本發明專利技術公開了一種斑節對蝦細胞周期蛋白H的基因序列及其制備方法和用途，旨在提供斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列及其制備方法，可以作為設計抗腫瘤藥物的靶位點或者調節斑節對蝦卵巢發育過程，有利于人工繁殖斑節對蝦細胞；該H基因序列的核苷酸如SEQ?ID?NO：1所示；制備方法是通過提取斑節對蝦總RNA來進行cDNA第一鏈的合成，再以合成的第一鏈cDNA作為模板，利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-F1、cycH-F2對目的基因的3ˊ末端進行兩次PCR擴增；然后對斑節對蝦細胞周期蛋白H基因進行測定，最后進行斑節對蝦細胞周期蛋白H基因分布和表達測定；屬于分子生物學中基因克隆領域。
【技術實現步驟摘要】
斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列及其制備方法和用途
本專利技術涉及一種細胞周期蛋白H基因序列，具體地說，是涉及一種斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列，本專利技術還涉及該斑斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，屬于分子生物學中基因克隆領域。
技術介紹
細胞周期調控是一個精確調控的過程。在細胞分裂過程中真核生物的細胞周期可以概括為兩個大的階段:細胞分裂間期(即Gl時期、S時期和G2時期)和細胞分裂期(即M時期)，在細胞分裂時期，需要許多周期蛋白參與調控以保證其精確性。周期蛋白H基因做為CAK的重要組成部分，從酵母到人類具有高度的保守型。CAK的激活需要周期蛋白H基因與CDK7及MATl結合，通過對CAK的磷酸化來實現其激酶活性。周期蛋白H基因也參與通用轉錄復合物TFIIH的構成。TFIIH是一個多蛋白復合物，在轉錄、DNA修復及細胞周期調控中起重要作用。與其他周期蛋白相比周期蛋白H基因在整個細胞周期中表達量穩定，所有周期時相均有表達。另有證據表明CDK2、CDK4及CDK6等的磷酸化都與周期蛋白H基因密切相關，周期蛋白H基因通過對這些底物的磷酸化從而實現對細胞周期的準確調控，進而可以實現對卵巢發育的調控。長期以來，斑節對蝦的人工繁育問題一直都是限制斑節對蝦養殖產業發展的技術瓶頸。在實際生產過程中，親蝦的性腺成熟參差不齊，難以集中育苗的問題是對蝦養殖過程中一個非常重要的限制因素。眼柄切除手術作為促進親蝦性腺同步成熟的常用方法，對親蝦本身存在非常大破壞性，不利于可持續養殖，加大了養殖成本。因此出于尋求一種新的對蝦繁育方法的需求，對對蝦卵巢發育機理及其分子調控機理進行研究勢在必行。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎，設計PCR擴增引物，并通過RACE技術克隆得到斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的全表達序列，有利于探究斑節對蝦卵巢發育相關機理，并為發現新的催熟方法提供一定的理論支持。為解決前一技術問題，本專利技術提供的第一個技術方案是這樣的:該斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本專利技術提供的后一技術方案是這樣的:該斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，依次包括下述方法:I)總RNA的提取對斑節對蝦解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃組織，并分別將各組織溶于Trizol中勻漿，提取斑節對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存；2)cDNA第一鏈的合成將步驟I)中的斑節對奸總RNA與反轉錄引物混合,在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈；3)斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的PCR擴增、克隆以步驟2)合成的第一鏈cDNA作為模板利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-Fl、cycH-F2對目的基因的:T末端進行兩次PCR擴增得PCR產物；4)對斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的測定對步驟3)所得到的PCR產物分離檢測、純化后，再將PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，挑取陽性克隆，測序；5)斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的分布和表達a)提取斑節對蝦不同組織以及不同發育時期的卵巢的總RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進行反轉錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用SYBR Green I染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析； b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 試劑盒說明書進行 PCR 反應，實驗數據采用相對ACT法分析斑節對蝦細胞周期蛋白H基因在各樣品中的相對表達量。進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟2)所述的反轉錄引物反轉錄引物為:5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反轉錄酶為M-MLV。進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟2)所述的反應條件:42°C 60min,70°C 15min。進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟3)所述的接頭引物為:5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟3)所述的cycH-Fl:5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG<3 ；cycH-F2:5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟3)中兩次擴增的所述反應條件均為:94°C,5min ；94°C,30s ；55°C ,45s, 35cycles ；72°C,60s ；72°C,IOmin0進一步的，上述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟b)中PCR反應使用引物步驟b)中PCR反應使用引物為:RTCYCH-F: 5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ；RTCYCH-R:5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。該斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列作為設計抗腫瘤藥物的靶位點或者調節斑節對蝦卵巢發育過。與現有技術相比，本專利技術提供的技術方案具有如下優點:1、本專利技術提供的技術方案是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎設計的PCR擴增引物，并通過RACE技術克隆到斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的全表達序列；此外通過斑節對蝦細胞周期蛋白H基因設計熒光定量PCR引物，對周期蛋白H基因在斑節對蝦卵巢各個發育時相的分布情況及在不同組織中的分布情況進行研究分析，更好的了解生物體細胞中的信號通路的機制。不僅為研究斑節對蝦細胞周期蛋白H基因在卵巢發育中的作用奠定基礎，而且可以為斑節對蝦養殖過程中所出現的性腺發育參差不齊的情況從分子層面提供理論基礎；有利于人工繁育斑節對蝦，并且減小了養殖成本。2、本專利技術提供的細胞周期蛋白H作為細胞周期調控中一個重要的蛋白，在細胞分裂、細胞周期調控、腫瘤發生、DNA的轉錄修復等方面起重要作用，也是對相關方向進行研究的一個重要突破點，可以用來作為抗腫瘤藥物設計的靶位點，在斑節對蝦卵巢發育過程中起重要作用。【附圖說明】圖1是斑節對蝦細胞周期蛋白H基因mRNA組織表達模式；其中:垂直線表示平均值土標準誤差(重重復樣品數=4)，不同的字母表示存在顯著性差異(p〈0.05)。圖2是斑節對蝦細胞周期蛋白H基因mRNA卵巢發育六期表達模式；其中:垂直線表示平均值土標準誤差(重重復樣品數=4)。不同的字母表示存在顯著性差異(p〈0.05)。【具體實施方式】為了更好的理解、實施本專利技術的權利要求，下面結合具體實施例，對本專利技術的權利要求做進一步的詳細說明，但本專利技術并不限于下述實施例，而是以權利要求為限。1、總RNA的提取試驗所用的雌雄斑節對蝦(鮮重200g左右)均取自于海南三亞，室內水族箱內暫養三天，水溫控制在24~25°C之間。解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃等組織，并分別將組織于ImL Trizol (Invitrogen,日本)中勻衆，按Trizol試劑盒使用手冊提取斑節對蝦總R本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
1.一種斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO=I所示。2.制備權利要求1所述的斑節對蝦細胞周期蛋白H基因序列的方法，其特征在于，依次包括下述方法: 1)總RNA的提取 對斑節對蝦解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃組織，并分別將各組織溶于Trizol中勻漿，提取斑節對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存； 2)cDNA第一鏈的合成 將步驟I)中的斑節對奸總RNA與反轉錄引物混合,在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈; 3)斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的PCR擴增、克隆 以步驟2)合成的第一鏈cDNA作為模板利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-F1、cycH-F2對目的基因的:T末端進行兩次PCR擴增得PCR產物； 4)對斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的測定 對步驟3)所得到的PCR產物分離檢測、純化后，再將PCR產物連接到到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌D H5ci感受態細胞，挑取陽性克隆，測序； 5)斑節對蝦細胞周期蛋白H基因的表達分布研究 a)提取斑節對奸不同組織以及不同發育時期的卵巢的總RNA,按照PremeScriptTMRTreagent Kit操作手冊進行反轉錄為cDNA模板；將不同組織樣品的cDNA進行稀釋作為后續實驗模板，采用SYBR Green I染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析； b)依照TaKaRaSYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit試劑盒說明書進行PCR反應，實驗數據采用相對ACT法對斑節對蝦細胞周期蛋白H基因在各樣品中的相對表達量進行分析。3.根據權利要求2所述的斑節對蝦細胞...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙超，邱麗華，江世貴，周發林，傅明駿，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院南海水產研究所，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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