一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法，該方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動(dòng)物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了所述板層角膜基質(zhì)支架在作為角膜基質(zhì)替代物中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)的方法最大程度地減少了對(duì)角膜基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的破壞，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，板層結(jié)構(gòu)保留完整，提高了支架材料的生物相容性。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及角膜基質(zhì)替代物領(lǐng)域，具體地，涉及一種板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
角膜位于眼球最表面，直接與外界接觸，容易受到損傷(物理、化學(xué))和感染，一旦發(fā)生病變則會(huì)發(fā)生混濁而影響視力，甚至致盲。常見的角膜病變有角膜炎、角膜潰瘍、圓錐角膜、角膜軟化癥和角膜變性等。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，目前全世界有角膜病盲患者近5000萬人，我國有約400萬人。角膜病嚴(yán)重影響了患者們的正常生活、工作與學(xué)習(xí)，生活上需要家人和社會(huì)的照顧，增加了家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也加重了全社會(huì)的負(fù)擔(dān)。角膜移植是角膜病盲患者恢復(fù)視力和復(fù)明的唯一希望，但由于我國角膜捐獻(xiàn)數(shù)量極其有限，全國每年能進(jìn)行的角膜移植手術(shù)目前僅有3000余例，致使絕大多數(shù)患者因得不到可用的供體角膜而無法重見光明。目前，國內(nèi)外同類產(chǎn)品主要以羊膜、膠原及其他合成高分子材料用于角膜移植研究，但都存在不同的缺陷。羊膜相對(duì)較薄，僅適用于治療眼表淺度損傷。合成材料的透明性和穩(wěn)定性較差，在降解過程中降解產(chǎn)物可引起局部PH值下降，術(shù)區(qū)出現(xiàn)非特異性無菌性炎癥反應(yīng)率較高。膠原是組織工程常用的材料，但純膠原韌性差，易碎，降解過快，手術(shù)后一段時(shí)間內(nèi)就發(fā)生碎裂，無法達(dá)到復(fù)明的效果，因此目前仍停留在基礎(chǔ)研究階段。相比而言，異種角膜基質(zhì)材料來源豐富，具有與正常角膜基質(zhì)相似的組織結(jié)構(gòu)，移植之后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度不變。天然的角膜基質(zhì)層存在著某些生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和分化，而且免疫原性低，神經(jīng) 可以長(zhǎng)入，有利于角膜知覺的恢復(fù)。此外，由于異種移植供體來源的動(dòng)物，如豬，在生理上與人類具有高度相似性，故其組織或器官被認(rèn)為是理想的供體之一，以豬作為異種移植供體來源的研究比較深入，豬的組織器官(如心臟瓣膜、胰島細(xì)胞、凝血因子等)已用于人類疾病的治療，異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)已被批準(zhǔn)用于臨床。豬角膜基質(zhì)含有角膜細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的I型膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有良好的生物相容性，能夠成為有效的角膜基質(zhì)替代物。異種移植供體來源的動(dòng)物(如豬)的角膜基質(zhì)組織中含有自身固有的細(xì)胞，需經(jīng)過脫細(xì)胞處理才能獲得無免疫原性或免疫原性較低的角膜基質(zhì)替代物。現(xiàn)有的角膜基質(zhì)替代物主要通過將動(dòng)物源性角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理獲得，且酶消化一般采用含有胰酶的緩沖液進(jìn)行處理。這樣的方法對(duì)制備得到的角膜基質(zhì)替代物的膠原板層結(jié)構(gòu)破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較低，并不能完全滿足臨床移植的要求。因此，研發(fā)一種能夠完全脫除異種移植供體來源的動(dòng)物(如豬)角膜基質(zhì)中的細(xì)胞成分，對(duì)膠原板層結(jié)構(gòu)破壞極小，使所得角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整且膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規(guī)則且透光率較高的角膜基質(zhì)替代物的制備方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是為了克服現(xiàn)有方法對(duì)制備得到的角膜基質(zhì)替代物的膠原板層結(jié)構(gòu)破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較低，并不能完全滿足臨床移植要求的缺陷，提供一種膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規(guī)則且透光率較高的板層角膜基質(zhì)支架及其制備方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)的專利技術(shù)人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，在制備板層角膜基質(zhì)支架時(shí)，采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行酶消化處理，并在酶消化處理之后干燥處理之前進(jìn)行超聲處理，不僅能夠完全脫除角膜基質(zhì)中的細(xì)胞成分，而且能夠最大程度地減少對(duì)角膜基質(zhì)膠原板層結(jié)構(gòu)的破壞，使所得角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整且膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規(guī)則、透光率高，與人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有理想的生物相容性，能夠最大程度地滿足移植要求。因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本專利技術(shù)提供了一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動(dòng)物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。第二方面，本專利技術(shù)提供了所述方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架。第三方面，本專利技術(shù)還提供了所述板層角膜基質(zhì)支架在作為角膜基質(zhì)替代物中的應(yīng)用。 本專利技術(shù)的板層角膜基質(zhì)支架，來源豐富，生物相容性及生物安全性好，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規(guī)則，無細(xì)胞殘留，角膜基質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)保留完整；理化性能良好，角膜透光率為70% -80% ;機(jī)械強(qiáng)度高，能夠耐受手術(shù)縫線牽拉、韌性良好并能長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，主要用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、疤痕、化學(xué)或熱燒傷等致盲性眼病，將病變處被損壞的角膜切除并將同樣尺寸的板層角膜基質(zhì)支架植入患者眼中，能夠達(dá)到構(gòu)建健康角膜組織、改善患者視力的效果。本專利技術(shù)方法中，為了最大程度地使支架材料滿足移植要求，對(duì)各步驟的條件包括時(shí)間、溫度、酶種類選擇及酶濃度、超聲頻率及超聲時(shí)間等進(jìn)行了詳細(xì)周密的設(shè)計(jì)和嚴(yán)格反復(fù)的驗(yàn)證。通過一系列實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化，使本專利技術(shù)的方法具有以下特點(diǎn):I)本專利技術(shù)方法的工藝流程簡(jiǎn)單可靠，周期短。2)本專利技術(shù)方法采用的原料來源廣泛，成本低，使用方便。3)本專利技術(shù)的方法，最大程度地減少了對(duì)角膜基質(zhì)膠原結(jié)構(gòu)的破壞，膠原纖維排列整齊，無細(xì)胞殘留，前彈力層及基底膜都保留，便于上皮層的生長(zhǎng)，提高了支架材料的生物相容性。4)本專利技術(shù)方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架，通過自檢、型式檢驗(yàn)驗(yàn)證了該產(chǎn)品的安全性，結(jié)果顯示其機(jī)械性能、理化性能及生物學(xué)性能都滿足臨床移植的要求。5)本專利技術(shù)方法制備得到的板層角膜基質(zhì)支架，適合用于基質(zhì)層異常角膜的臨床移植，使眾多角膜基質(zhì)異常患者重見光明成為可能，為組織工程角膜產(chǎn)業(yè)提供了重要的技術(shù)支持。本專利技術(shù)的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明?！靖綀D說明】圖1是本專利技術(shù)實(shí)施例1制備得到的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖。圖2是正常人角膜板層結(jié)構(gòu)的冰凍切片圖。圖3是本專利技術(shù)對(duì)比例I制備得到的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖。圖4是本專利技術(shù)對(duì)比例2制備得到的板層角膜基質(zhì)支架的冰凍切片圖。【具體實(shí)施方式】 以下對(duì)本專利技術(shù)的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說明和解釋本專利技術(shù)，并不用于限制本專利技術(shù)。第一方面，本專利技術(shù)提供了一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動(dòng)物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其中，酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。根據(jù)本專利技術(shù)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在無菌條件下切取角膜基質(zhì)片前，一般先將新鮮動(dòng)物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS緩沖液可以為I XPBS緩沖液。對(duì)于酒精和妥布霉素的濃度以及浸泡時(shí)間沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常用的濃度和浸泡時(shí)間。優(yōu)選情況下，酒精的體積百分濃度為70-80%，進(jìn)一步優(yōu)選為75% ;妥布霉素的濃度為30000-50000U/L，進(jìn)一步優(yōu)選為40000U/L ;浸泡時(shí)間為10_30s。對(duì)于切取的角膜基質(zhì)片的直徑和厚度沒有特別的要求，可以為本領(lǐng)域常規(guī)的角膜基質(zhì)片的直徑和厚度。優(yōu)選情況下，切取的角膜基質(zhì)片的直徑為8-10mm，厚度為200-600 μ mD為了提高制得的板層角膜基質(zhì)支架和人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生物相容性，優(yōu)選情本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動(dòng)物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種板層角膜基質(zhì)支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動(dòng)物眼球的角膜基質(zhì)片依次進(jìn)行低滲溶脹、反復(fù)凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進(jìn)行處理，并在酶消化處理后進(jìn)行超聲處理，然后再進(jìn)行干燥和滅菌處理。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酶消化處理的條件包括:DNA酶與緩沖液的體積比為1:500-1500, RNA酶與緩沖液的體積比為1:1500-2500，溫度為30_40°C，時(shí)間為2—4h03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述超聲處理的條件包括:溫度為20-40°C，超聲功率為200-500W，超聲時(shí)間為2-5h。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述在無菌條件下切取新鮮動(dòng)物眼球的角膜基質(zhì)片的方法包括:先將新鮮動(dòng)物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡，再在無菌條件下切取角膜基質(zhì)片；所述酒精的體積百分濃度優(yōu)選為70-80%，所述妥布霉素的濃度優(yōu)選為30000-50000U/L，所述浸泡時(shí)間優(yōu)選為10_30s ;所述切取的角膜基質(zhì)片的直徑優(yōu)選為8-10mm，厚度優(yōu)選為200-600 μ m ;所述動(dòng)物優(yōu)選為豬、?；蚝?..

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李青，王寶泉，彭艷婷，王紅梅，李海燕，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島中皓生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37