角膜緣干細胞及其培養方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種角膜緣干細胞及其培養方法和應用，其中，該角膜緣干細胞的培養方法包括步驟如下：獲取可增殖角膜緣組織；將所述可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中培養；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中的濃度為0.01～0.09mmol/L。本發明專利技術角膜緣干細胞的培養方法可以抑制角膜緣干細胞的分化，避免角膜緣干細胞因分化而產生其他細胞，保證培養得到的角膜緣干細胞的純度，降低分化程度，從而提高了移植角膜緣干細胞治療相應眼部疾病的療效。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及干細胞
，尤其涉及一種角膜緣干細胞及其培養方法和應用。
技術介紹
角膜由外而內依次包括：上皮層、前彈力層(Bowman膜)、基質層、后彈力層(Decemet膜)和內皮層。角膜上皮層具有多層細胞，包括與前彈力層連接的基底層細胞。角膜上皮層具有保護眼球，穩定淚膜，維持角膜透明性等功能，是一種不斷自我更新的組織，而且，角膜上皮層的完整性的維持依賴于表淺細胞不斷脫落和基底層細胞不斷增殖以取代脫落細胞來實現，而上皮細胞持續不斷的水平向心運動和垂直向上運動就源于角膜緣基底層干細胞的增殖和分化。角膜緣是角膜和結膜的移行區，角膜緣上皮層多于10層，干細胞存在于角膜緣上皮層的基底層，在保持角膜的生理生化和角膜的營養及完整性的維持、免疫反應中占有重要地位。角膜緣干細胞不僅可以分化、增殖為角膜上皮細胞，更重要的是干細胞像一道屏障，阻止結膜上皮細胞移行至角膜表面，這對于保持角膜的透明性與正常生理功能有著重要的意義。角膜病是我國第二位致盲眼部疾病。隨著現代眼科學的發展，角膜緣干細胞缺乏或功能障礙的疾病，如眼表淚液病、無虹膜、化學和熱燒傷、輻射損害、Stevens-Johnson綜合征、眼瘢痕性天皰瘡等，可以通過角膜緣干細胞移植進行治療。因此，角膜緣干細胞對于上述眼部疾病的治療起著至關重要的作用。然而，現有方法培養的角膜緣干細胞的純度低，分化程度高，進而導致使用該角膜緣干細胞進行移植時，對上述眼部疾病的治療效果不佳。
技術實現思路
本專利技術的主要目的在于提供一種角膜緣干細胞的培養方法，旨在提高培養的角膜緣干細胞的純度，降低分化程度。為實現上述目的，本專利技術提供一種角膜緣干細胞的培養方法，所述角膜
緣干細胞的培養方法包括步驟如下：獲取可增殖角膜緣組織；將所述可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中培養；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中的濃度為0.01～0.09mmol/L。優選地，所述將所述可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中的步驟之后，還包括步驟如下：向所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中加入堿性成纖維細胞生長因子，使所述堿性成纖維細胞生長因子的濃度為1～100ng/ml。優選地，所述獲取可增殖角膜緣組織的步驟，包括：獲取角膜緣組織；將所述角膜緣組織置于無鈣MEM培養基中培養，當所述角膜緣組織的上皮層的基底層細胞和與所述基底層細胞相連的上層細胞出現間隙時，除去所述上層細胞，而獲得可增殖角膜緣組織。優選地，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中的濃度為0.06mmol/L。優選地，所述堿性成纖維細胞生長因子的濃度為10～60ng/ml。優選地，所述堿性成纖維細胞生長因子的濃度為15ng/ml。優選地，所述堿性成纖維細胞生長因子為重組牛堿性成纖維細胞生長因子。優選地，所述FBS在所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中的質量分數為1～14％。本專利技術還提供一種上述角膜緣干細胞的培養方法獲得的角膜緣干細胞。本專利技術還提供一種上述角膜緣干細胞在制備治療角膜病藥劑中的應用。本專利技術技術方案，通過采用低鈣的MEM培養基對角膜緣組織進行培養而得到角膜緣干細胞，同時可以抑制角膜緣干細胞的分化，避免角膜緣干細胞因分化而產生其他細胞，保證培養得到的角膜緣干細胞的純度，降低分化程
度，從而提高了移植角膜緣干細胞治療相應眼部疾病的療效；進一步地，向MEM培養基中加入堿性成纖維細胞生長因子，該堿性成纖維細胞生長因子可以促進角膜緣干細胞的增殖，增加干細胞的數量，且可以保證角膜緣干細胞的活性。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖示出的內容獲得其他的附圖。圖1為本專利技術實施例1培養的角膜緣干細胞進行免疫細胞染色后的掃描電鏡示意圖，圖中箭頭標示了染色的細胞膜；圖2為本專利技術實施例2培養的角膜緣干細胞進行免疫細胞染色后的掃描電鏡示意圖；圖3為本專利技術實施例3培養的角膜緣干細胞進行免疫細胞染色后的掃描電鏡示意圖，圖中箭頭標示了染色的細胞膜。具體實施方式下面將結合本專利技術實施例中的附圖，對本專利技術實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本專利技術的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。本專利技術提供一種角膜緣干細胞的培養方法，該角膜緣干細胞的培養方法包括步驟如下：S1、獲取可增殖角膜緣組織；S2、將該可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中培養；其中，Ca2+在該含FBS和Ca2+的MEM培養基中的濃度為0.01～0.09mmol/L。本專利技術培養方法通過采用低鈣的MEM培養基對角膜緣組織進行培養而
得到角膜緣干細胞，可以抑制角膜緣干細胞的分化，避免角膜緣干細胞因分化而產生其他細胞，保證培養得到的角膜緣干細胞的純度，降低了分化程度，從而提高了移植角膜緣干細胞治療相應眼部疾病的療效。進一步地，在步驟S2之后，該角膜緣干細胞的培養方法還包括步驟如下：S3、向該含FBS和Ca2+的MEM培養基中加入堿性成纖維細胞生長因子，使堿性成纖維細胞生長因子的濃度為1～100ng/ml。該堿性成纖維細胞生長因子可以促進角膜緣干細胞的增殖，增加干細胞的數量，且可以保證角膜緣干細胞的活性。需要說明的是，根據本領域技術人員的常識，該堿性成纖維細胞生長因子的濃度僅為向MEM培養基中剛剛加入完時混合均勻的濃度，由于角膜緣組織具有活性，因此，不能理解為培養一段時間后的濃度。進一步地，該步驟S1具體包括如下步驟：S10、獲取角膜緣組織；S11、將該角膜緣組織置于無鈣MEM培養基中培養，當該角膜緣組織的上皮層的基底層細胞和與基底層細胞相連的上層細胞出現間隙時，除去上層細胞，而獲得可增殖角膜緣組織。該可增殖角膜緣組織的獲取方法簡單，只需將角膜緣組織培養一段時間，上層細胞和基底層細胞即可自行脫離。需要說明的是，本專利技術角膜緣組織的上皮層具有多層細胞，其中，角膜緣干細胞產生于角膜緣組織的上皮層的基底層細胞，而基底層細胞以上的上層細胞會隨著基底層細胞的生長而脫落。進一步地，該堿性成纖維細胞生長因子的濃度為10～60ng/ml。當堿性成纖維細胞生長因子濃度保持在10～60ng/ml可以保持對干細胞較高的增殖促進作用，且保持干細胞較高的活性。進一步地，FBS(胎牛血清)在含FBS和Ca2+的MEM培養基中的質量分數為1～14％。該胎牛血清可以為角膜緣組織提供細胞生長必須的營養成份，同時起酸堿度緩沖液作用。本專利技術還提供一種上述角膜緣干細胞的培養方法獲得的角膜緣干細胞。該角膜緣干細胞可以通過施行角膜緣干細胞移植，改善或重建眼表結構，有效地治療因角膜緣干細胞缺乏或功能障礙的疾病，同時提高療效。本專利技術還提供一種上述角膜緣干細胞在制備治療角膜病藥劑中的應用。將該角膜緣干細胞應用于制備治療角膜病藥劑中，如角膜片或干細胞制劑等等，方便角膜緣干細胞的存儲和活性本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種角膜緣干細胞的培養方法，其特征在于，包括步驟如下：獲取可增殖角膜緣組織；將所述可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中培養；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中的濃度為0.01～0.09mmol/L。

【技術特征摘要】
1.一種角膜緣干細胞的培養方法，其特征在于，包括步驟如下：獲取可增殖角膜緣組織；將所述可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中培養；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中的濃度為0.01～0.09mmol/L。2.如權利要求1所述的角膜緣干細胞的培養方法，其特征在于，所述將所述可增殖角膜緣組織加入含FBS和Ca2+的MEM培養基中的步驟之后，還包括步驟如下：向所述含FBS和Ca2+的MEM培養基中加入堿性成纖維細胞生長因子，使所述堿性成纖維細胞生長因子的濃度為1～100ng/ml。3.如權利要求1或2所述的角膜緣干細胞的培養方法，其特征在于，所述獲取可增殖角膜緣組織的步驟，包括：獲取角膜緣組織；將所述角膜緣組織置于無鈣MEM培養基中培養，當所述角膜緣組織的上皮層的基底層細胞和與所述基底層細胞相連的上層細胞出現間隙時，除去所述上層細胞，而獲得...

【專利技術屬性】
技術研發人員：曾憲卓，魯菲，
申請(專利權)人：深圳愛生再生醫學科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44