本發明專利技術公開了一種板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法，該方法可以使不同的檢測試劑用同一種通用包被板，該通用包被板可以與鏈親和素和熒光素結合。然后在不同的檢測項目的包被抗體上標記上生物素或者熒光素，間接的將包被抗體固定在通用包被板上。采用此發明專利技術前的包被板隨著項目不同而需要單獨生產，或者生物素標記成功率低，或者熒光素結合速率慢，分別有各自的缺點。采用本發明專利技術后能最大限度的提高標記成功率以及結合速率，還可以通用包被板，提高生產和應用簡便性。
【技術實現步驟摘要】
[0001 ] 本專利技術屬于免疫診斷
，應用于醫療檢驗機構。
技術介紹
目前國內外使用的板式化學發光免疫診斷試劑盒一般有兩種，一種是按檢測內容物不同包被不同的包被抗體，進而制成不同的固相包被板。每種固相包被板只能對應應用于一種檢測項目。人體可以用免疫診斷的指標有數百種。因此要想全部生產出對應的診斷試劑就需要生產數百種固相包被板。這對于生產和應用都帶來了復雜性。另一種方法進行了改良:將原來用于直接制備包被板的包被抗體標記上熒光素或者生物素，然后將抗熒光素抗體或鏈親和素包被在固相板上。由于抗熒光素抗體會特異性的結合熒光素(或者鏈親和素會特異性的結合生物素)這樣就間接的將原來不同檢測項目的不同固相包被板簡化成統一的抗熒光素抗體包被板或者鏈親和素包被板。但是這里又引入了新的問題。由于抗體的空間結構的多樣性導致生物素標記包被抗體成功率只有50%左右，經常會出現抗體與抗原特異性結合的可變區上的特異性氨基位點被生物素結合從而失去與抗原結合的能力。而熒光素標記抗體雖然是與抗體上的二硫鍵結合不影響抗體與抗原結合的特異性，一般成功率大于90 %。但是熒光素抗體與熒光素的反應速率僅有鏈親和素與生物素結合反應速率的萬分之一。
技術實現思路
針對現有技術中存在的缺陷，本專利技術公開了一種板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法，該方法可以使不同的檢測試劑用同一種通用包被板，大大減少生產的復雜性和增強應用的簡便性。本專利技術是合成一種新的蛋白用以制備一種通用包被板，這種通用包被板可以與鏈親和素和熒光素結合。然后在不同的檢測項目的包被抗體上標記上生物素或者熒光素，間接的將包被抗體固定在通用包被板上。采用此專利技術前的包被板隨著項目不同而需要單獨生產，或者生物素標記成功率低，或者熒光素結合速率慢，分別有各自的缺點。采用本專利技術后能最大限度的提高標記成功率以及結合速率，還可以通用包被板，提高生產和應用簡便性。本專利技術的板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法包括如下步驟:步驟1:取0.5?1.5mg分子量66KDa的鏈親和素和2.0?2.8mg分子量160KDa的抗熒光素抗體溶解于0.05?0.15ml,0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用；優選取Img分子的鏈親和素和2.4mg的抗熒光素抗體溶解于0.1ml的碳酸緩沖液中；步驟2:取70%的戊二醛0.05?0.15ml用蒸餾水稀釋70倍成0.5?1.5%濃度備用;優選取戊二醛0.1ml稀釋成I %濃度備用；步驟3:在步驟I制得的溶液中加入新鮮配制的1%戊二醛溶液0.05?0.15ml，室溫攪拌I小時。取出反應液加入透析袋，對0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，期間換液3次；要求透析袋透過直徑為160KDa ;將透析后的反應液加入等量甘油保存于-15?25°C;優選加入戊二醛溶液0.1ml ;優選將透析后的反應液加入等量甘油保存于-20°c ；步驟4:將新合成的包被蛋白甘油溶液用0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液稀釋到I: 1000，在96孔化學發光板中每孔加入50?150 μ I稀釋溶液，3?5°C靜置過夜；次日將板子拍桿，加入含有I %牛血清白蛋白的溶液150?250μ 1，37°C封閉反應0.5?1.5小時；將板子再次拍干，置于烘干間抽濕烘干后真空包裝，得到板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板。優選在化學發光板中每孔加入IOOul稀釋溶液，4°C靜置過夜；優選加入含有1%牛血清白蛋白的溶液200μ 1，37°C封閉反應I小時。通過本專利技術的方法制得的包被板，可以使得生產企業無論生產哪種類型的板式化學發光檢測試劑，都可以使用通用包被板。有利于擴大生產規模，減少半成品類型和批次，減少質量檢驗步驟，可提高產品穩定性和質量。對于使用者，所有的檢測項目的固相包被板通用可減少同時檢測多個項目導致操作失誤。【具體實施方式】為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下通過具體實施例對本專利技術的制備方法進一步詳細說明。實施例1:取Img鏈親和素(分子量66KDa)和2.4mg抗熒光素抗體(分子量160KDa)溶解于0.1ml0.05M pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用。取70%的戊二醛0.1ml用蒸餾水稀釋70倍成I %濃度備用。在鏈親和素和抗熒光素混合的溶液中加入新鮮配制的I %戊二醛溶液0.1ml，室溫攪拌I小時。取出反應液加入透析袋，對0.05M pH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，期間換液3次。要求透析袋透過直徑為160KDa。將透析后的反應液加入等量甘油保存于_20°C。.將新合成的包被蛋白甘油溶液用0.05M pH9.6的碳酸緩沖液稀釋到1: 1000。在96孔化學發光板中每孔加入100μ 1，4°C靜置過夜，次日將板子拍桿，加入含有1%牛血清白蛋白的溶液200μ 1，37°C封閉反應I小時。將板子再次拍干，置于烘干間抽濕烘干后真空包裝。取0.1mg抗甲胎蛋白AFP包被抗體置于0.1ml0.05M ρΗ9.6的碳酸緩沖液中，加入4 μ g酯化生物素和4 μ g熒光素，室溫攪拌I小時。反應液對0.05MpH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，中間換液3次。要求透析袋透過直徑為40KDa。將透析后的反應液加入等量甘油保存于-20°C。將前一步驟制備得的生物素熒光素標記物用標記物稀釋液稀釋1000倍，再加入一定量的抗AFP另一株抗體辣根過氧化物酶標記物作為標記物工作液。往通用包被板中加入50 μ I標準血清或待測血清以及100 μ I標記物工作液后混合均勻，置于37°C恒溫箱溫育I小時。取出板子洗滌5次后加入發光底物，檢測發光信號，進而建立標準曲線求出待測血清中AFP濃度。以上過程中標記物工作液中事實上有2種抗AFP抗體，一株抗體標記上了生物素和熒光素，與通用包被板接觸后立即與鏈親和素或抗熒光素抗體結合而固定到化學發光板上。另一株抗AFP抗體上連接著辣根過氧化物酶，此為檢測時候的示蹤物。此兩個抗體通過溫育后形成:通用包被板-生物素(或熒光素)化抗體-抗AFP抗體-AFP抗原-另一株抗AFP抗體辣根過氧化物酶標記物的復合物。以上是以甲胎蛋白(英文簡寫AFP)檢測方法為例，類似的方法可以應用在癌胚抗原，前列腺特異性抗原等等檢測項目上，只要將其中一株抗體如上處理即可。實施例2:步驟1:取Img分子量66KDa的鏈親和素和2.4mg分子量160KDa的抗熒光素抗體溶解于0.1mU0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用；步驟2:取70% 的戊二醛0.1ml用蒸餾水稀釋70倍成I %濃度備用；步驟3:在步驟I制得的溶液中加入新鮮配制的1%戊二醛溶液0.1ml，室溫攪拌I小時。取出反應液加入透析袋，對0.05M pH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，期間換液3次；要求透析袋透過直徑為160KDa ;將透析后的反應液加入等量甘油保存于_20°C ；步驟4:將新合成的包被蛋白甘油溶液用0.05M pH9.6的碳酸緩沖液稀釋到I: 1000;在96孔化學發光板中每孔加入100μ1，4?靜置過夜；次日將板子拍桿，加入含有1%牛血清白蛋白的溶液200μ 1，37°C封閉反應I小時；將板子再次拍干，置于烘干間抽濕烘干后真空包裝，得到板式化學發光免疫診斷本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：步驟1：取0.5～1.5mg分子量66KDa的鏈親和素和2.0～2.8mg分子量160KDa的抗熒光素抗體溶解于0.05～0.15ml、0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用；步驟2：取70％的戊二醛0.05～0.15ml用蒸餾水稀釋70倍成0.5～1.5％濃度備用；步驟3：在步驟1制得的溶液中加入新鮮配制的1％戊二醛溶液0.05～0.15ml，室溫攪拌1小時。取出反應液加入透析袋，對0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，期間換液3次；要求透析袋透過直徑為160KDa；將透析后的反應液加入等量甘油保存于?15～25℃；步驟4：將新合成的包被蛋白甘油溶液用0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液稀釋到1∶1000，在96孔化學發光板中每孔加入50～150μl稀釋溶液，3～5℃靜置過夜；次日將板子拍桿，加入含有1％牛血清白蛋白的溶液150～250μl，37℃封閉反應0.5～1.5小時；將板子再次拍干，置于烘干間抽濕烘干后真空包裝，得到板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板。
【技術特征摘要】
1.一種板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟1:取0.5?1.5mg分子量66KDa的鏈親和素和2.0?2.8mg分子量160KDa的抗熒光素抗體溶解于0.05?0.15ml,0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液中，加入攪拌子備用； 步驟2:取70%的戊二醛0.05?0.15ml用蒸餾水稀釋70倍成0.5?1.5%濃度備用； 步驟3:在步驟I制得的溶液中加入新鮮配制的I %戊二醛溶液0.05?0.15ml，室溫攪拌I小時。取出反應液加入透析袋，對0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液透析過夜，期間換液3次；要求透析袋透過直徑為160KDa ;將透析后的反應液加入等量甘油保存于-15?25°C ； 步驟4:將新合成的包被蛋白甘油溶液用0.05M、pH9.6的碳酸緩沖液稀釋到1: 1000，在96孔化學發光板中每孔加入50?150 μ I稀釋溶液，3?5°C靜置過夜；次日將板子拍桿，加入含有1%牛血清白蛋白的溶液150?250μ 1，37°C封閉反應0.5?1.5小時；將板子再次拍干，置于烘干間抽濕烘干后真空包裝，得到板式化學發光免疫診斷試劑通用固相包被板。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟I中，取Img分子的鏈親和素和2.4mg的抗熒光素抗體溶解于0.1ml的碳酸緩沖液中。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟2中，取戊二醛0.1ml稀釋成I %濃度備用。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟3中，加入戊二醛溶液0.1ml05.如權利要求1所述的制備方法，其特征在...
【專利技術屬性】
技術研發人員：林斯，
申請(專利權)人：林斯，
類型：發明
國別省市：北京;11
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