一種微量多肽化學(xué)衍生體系及衍生方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成；其中，最上層的填料為反相硅膠，中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠，最下層的填料為反相硅膠。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了所述微量多肽化學(xué)衍生體系的制備方法，以及應(yīng)用所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及多肽分析領(lǐng)域，具體涉及一種微量多肽化學(xué)衍生體系及該體系的制備方法，還涉及利用該微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法。
技術(shù)介紹
在質(zhì)譜(Mass Spectrometry, MS)技術(shù)中，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可用于獲得目標(biāo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的碎片，從而對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。目前，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS/MS)可以很容易地分離與裂解復(fù)雜的多肽混合物，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。數(shù)據(jù)庫檢索法是使用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析時(shí)的常規(guī)方法。該方法是從特定的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中提取目標(biāo)物質(zhì)所有的肽段序列，并將它們與串聯(lián)質(zhì)譜所得譜圖進(jìn)行比較和打分，找到可能性最大的肽段序列。但是，對(duì)于基因組未測(cè)序的物質(zhì)，由于無法建立相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，常規(guī)的數(shù)據(jù)庫檢索方法無法獲得可以與質(zhì)譜譜圖進(jìn)行比較分析的多肽序列。多肽從頭測(cè)序技術(shù)通過串聯(lián)質(zhì)譜譜圖上碎片離子之間的質(zhì)量差得到對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，可得到所有物種的肽段序列及翻譯后修飾，無需借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和比較即可對(duì)多肽序列進(jìn)行鑒定。多肽從頭測(cè)序有著很大的發(fā)展?jié)摿Γ悄壳暗涂尚哦鹊蔫b定結(jié)果限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。這種低可信度主要是由不充分的裂解以及同時(shí)產(chǎn)生的N-端系列離子和C-端系列離子相互重疊導(dǎo)致的。目前，為了避免N-端與C-端系列離子的重疊，提高多肽從頭測(cè)序的可信度，可采用多肽N-末端衍生技術(shù)進(jìn)行圖譜簡(jiǎn)化處理。該技術(shù)包括多肽N-末端的負(fù)電荷衍生與正電荷衍生。其中，多肽N-末端正電荷衍生是指在多肽N-末端引入一個(gè)季銨基團(tuán)或季膦基團(tuán)，從而提高二級(jí)譜圖中多肽N-末端碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度。(琥珀酰亞胺氧基擬基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化憐(Succinimidyloxycarbonylmethyltris(2, 4, 6-trimethoxyphenyl)phosphonium bromide, TMPP-Ac-OSu)是一種重要的多妝N-端正電荷衍生試劑，它可在一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、溫和的條件下對(duì)多肽的N-端進(jìn)行特異性的衍生。傳統(tǒng)的TMPP-Ac-OSu衍生方法為溶液方法，其缺點(diǎn)是衍生反應(yīng)產(chǎn)生大量以TMPP-Ac-OH為主的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響微量樣品(〈lpmol)或者復(fù)雜樣品中低豐度多肽的序列分析。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種微量多肽化學(xué)衍生體系，并提供該體系的制備方法。本專利技術(shù)的另一目的是提供利用所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行正電荷衍生的方法，該方法可有效去除衍生反應(yīng)副產(chǎn)物，減少多肽衍生物的損失，提高衍生多肽的質(zhì)譜分析靈敏度。本專利技術(shù)提供了一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成，分別為最上層、中間層和最下層。具體地，最上層為衍生反應(yīng)層；其作用為為衍生反應(yīng)中的肽段與衍生試劑提供固相結(jié)合介質(zhì)。最上層的厚度為3?5mm。最上層的填料為反相硅膠填料，填料粒徑為3?10 μ m。所述反相硅膠選用C8或C18,優(yōu)選為C8。中間層為副產(chǎn)物去除層；其作用為去除衍生反應(yīng)中的鹽離子和反應(yīng)副產(chǎn)物等雜質(zhì)；作用原理為陽離子交換原理，即:衍生肽段與填料結(jié)合，副產(chǎn)物被洗脫。中間層的厚度為3?5mm。中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠SCX填料，填料粒徑為3?10 μ m。最下層為脫鹽洗脫層；其作用為將衍生反應(yīng)中的各種鹽去除得到純化的衍生多肽；作用原理為反相色譜洗脫原理，即:衍生肽段與填料結(jié)合，鹽被洗脫。最下層的厚度為3?5mm。最下層的填料為反相硅膠填料，填料粒徑為3?10 μ m。所述反相硅膠選用C8或C18，優(yōu)選為C8。所述Eppendorf槍頭為實(shí)驗(yàn)室常用Eppendorf槍頭,規(guī)格為200 μ I。本專利技術(shù)還提供了所述微量多肽化學(xué)衍生體系的制備方法。所述方法包括以下步驟:I)將一片直徑為I?2mm的特氟龍薄膜水平放置到Eppendorf槍頭底部，以防止填料漏出；2)將反相硅膠的甲醇懸濁液緩慢加入特氟龍薄膜之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 Xg,離心時(shí)間為5min,最下層即得；3)將SCX的甲醇懸濁液緩慢加入步驟2)所得最下層之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 Xg,離心時(shí)間為5min,中間層即得；4)將反相硅膠的甲醇懸濁液緩慢加入步驟3)所得中間層之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為lOOOXg，離心時(shí)間為5min，微量多肽化學(xué)衍生體系即得。本專利技術(shù)還提供了利用所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法。所述方法包括以下步驟:衍生體系的平衡；樣品與正電荷衍生試劑的載入；正電荷衍生反應(yīng)；副產(chǎn)物的洗脫；衍生多肽的脫鹽；衍生多肽的洗脫。具體地，所述正電荷衍生試劑選用TMPP-Ac-OSu ；所述副產(chǎn)物包括TMPP-Ac-OH ；所述方法包括以下具體步驟:I)衍生體系的平衡:使用45%乙腈100 μ L進(jìn)行系統(tǒng)的清洗，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行系統(tǒng)的平衡；2)樣品的載入:將多肽樣品與TMPP-Ac-OSu衍生試劑以質(zhì)量比1:2溶解于含5%乙腈與0.1 %三氟乙酸的溶液100 μ L，載入微量反應(yīng)體系最上層；3)衍生反應(yīng):載入ρΗ8.2、濃度為20mmol/L的碳酸氫鈉緩沖液100 μ L，引發(fā)衍生反應(yīng)；室溫下孵育2小時(shí)后，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行清洗，終止衍生反應(yīng)；4)副產(chǎn)物的去除:使用ΡΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀和45%乙腈的緩沖液AlOO μ L進(jìn)行洗脫，將衍生多肽產(chǎn)物從最上層洗脫下來并結(jié)合到中間層，同時(shí)將以TMPP-Ac-OH為主的衍生反應(yīng)副產(chǎn)物除去；使用ρΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀、500mmol/L氯化鉀和45 %乙腈的緩沖液BlOO μ L進(jìn)行洗脫，將衍生多肽產(chǎn)物從中間層洗脫下來并結(jié)合到最下層；5)衍生多肽的脫鹽:使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行洗脫，去除衍生反應(yīng)中的鹽雜質(zhì)；6)衍生多肽的洗脫:使用45%乙腈100μ L進(jìn)行洗脫，衍生多肽樣品即得。本專利技術(shù)還提供了所述微量多肽化學(xué)衍生體系在多肽從頭測(cè)序中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將由所述衍生體系及相應(yīng)衍生方法得到的衍生多肽用于質(zhì)譜分析。本專利技術(shù)具有以下顯著技術(shù)效果:1、傳統(tǒng)的正電荷衍生反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，衍生多肽與大量副產(chǎn)物和雜質(zhì)混合在一起，影響反應(yīng)效率和后續(xù)的質(zhì)譜分析；本專利技術(shù)提供的微量多肽化學(xué)衍生體系結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，能有效去除副產(chǎn)物和雜質(zhì)，顯著提高了多肽正電荷衍生反應(yīng)的效率和衍生多肽的質(zhì)譜分析靈敏度；2、本專利技術(shù)提供的微量多肽化學(xué)衍生體系將多肽的衍生與副產(chǎn)物的去除和脫鹽有效整合在一個(gè)體系內(nèi)進(jìn)行，可有效降低由于樣品多次轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的樣品損失。【附圖說明】圖1為本專利技術(shù)所述微量多肽化學(xué)衍生體系結(jié)構(gòu)圖；其中，I為Eppendorf槍頭；2為最上層C8或C18填料層；3為中間層SCX填料層；4為最下層C8或C18填料層。圖2為利用C8-SCX-C8衍生體系進(jìn)行多妝正電荷衍生反應(yīng)流程圖。圖3為大鼠C6細(xì)胞的正電荷衍生多肽的總離子流圖，其中，(A)為傳統(tǒng)溶液衍生方法所得衍生多肽使用C18色譜柱分離所得總離子流圖，(B)為本專利技術(shù)所述方法所得衍生多肽使用C18色譜柱分離所得總離子流圖，(C)為本專利技術(shù)所述方法所得衍生多肽使用C8色譜柱分離所得總離子流圖。【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1:C8-SCX_C8S本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成；其中，最上層的填料為反相硅膠，中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠，最下層的填料為反相硅膠。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成；其中，最上層的填料為反相硅膠，中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠，最下層的填料為反相硅膠。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，各填料層的厚度為3?5mm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，各填料的粒徑為3?10μ m。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，所述反相硅膠選用C8或C18，優(yōu)選為c8。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，所述Eppendorf槍頭為實(shí)驗(yàn)室常用Eppendorf槍頭，規(guī)格為200 μ I。6.權(quán)利要求1所述微量多肽化學(xué)衍生體系的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)將一片直徑為I?2mm的特氟龍薄膜水平放置到Eppendorf槍頭底部； 2)將反相硅膠懸濁液緩慢加入特氟龍薄膜之上，進(jìn)行離心，最下層即得； 3)將磺酸基陽離子交換鍵合硅膠懸濁液緩慢加入步驟2)所得最下層之上，進(jìn)行離心，中間層即得； 4)將反相硅膠懸濁液緩慢加入步驟3)所得中間層之上，進(jìn)行離心，微量多肽化學(xué)衍生體系即得； 其中，各離心步驟的離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 X g，離心時(shí)間為5min。7.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: I)衍生體系的平衡；2)樣品與正電荷衍生試劑...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：紀(jì)建國，王青松，安明瑞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11