本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種新型的特異性細胞免疫應(yīng)答體外檢測方法及其臨床應(yīng)用，該方法包括Sm合成肽抗原的合成及篩選，待檢血液與Sm混合肽抗原的混合培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)血上清液中特定細胞因子的水平。該檢測方法可以應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床的輔助診斷和治療監(jiān)控。本發(fā)明專利技術(shù)具備多種臨床應(yīng)用功能，而且簡便快速，容易操作,可靈活運用等特點，具有很好的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
新型的特異性細胞免疫應(yīng)答體外檢測方法及其臨床應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于臨床免疫及醫(yī)學(xué)實驗診斷領(lǐng)域，具體涉及一種新型的細胞免疫應(yīng)答體外檢測技術(shù)。這種實驗方法基于檢測由Smith (Sm)合成肽抗原體外刺激外周血T細胞產(chǎn)生的細胞因子水平，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的實驗診斷和治療監(jiān)控提供參考。
技術(shù)介紹
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是影響人群最廣泛、最嚴(yán)重的自身免疫病之一，通常好發(fā)于育齡女性，能引發(fā)全身多種組織及器官的炎癥病變。由于該疾病發(fā)作潛伏，病程遷延反復(fù)并不斷加重，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，診斷和治療難度大，世界衛(wèi)生組織把它列為新世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急待攻克的堡壘。該疾病的病因目前尚不清楚。傳統(tǒng)的觀點是SLE患者的多器官炎癥損害主要歸因于體液免疫紊亂引起的B細胞異常活化產(chǎn)生的多種自身抗體，并通過抗原抗體免疫復(fù)合物沉積并激活補體等途徑造成。因此，臨床診斷，病情監(jiān)控及治療的參考實驗指標(biāo)幾乎都依賴血清中自身抗體。而近年來的大量研究表明，細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其產(chǎn)生的細胞因子，特別是炎癥性的細胞因子等異常可能是造成紅斑狼瘡病理炎癥的另一關(guān)鍵原因(YAP，D.Y.& LAIj K.N.Cytokines and their roles in the pathogenesis of systemiclupus erythematosus: from basics to recent advances.J Biomed Biotechnolj 2010，365083.)，并與體液免疫相互作用，在整個疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用(DAVIS，L S.，HUTCHESON, J.& MOHAN, C.The role of cytokines in the pathogenesis andtreatment of systemic lupus erythematosus.J Interferon Cytokine Res, 2011，31，781-9.)。最近Iwata報道了一些SLE病人甚至出現(xiàn)以T細胞免疫紊亂為主導(dǎo)的發(fā)病機制(IWATA, S.，SAIT0, K., T0KUNAGA, M.& TANAKA, Y.B cell or T cell-dominantrecurrence after rituximab therapy in patients with SLE.Ann Rheum Dis.2012.)。這樣，檢測細胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(如細胞因子)與自身抗體一樣，對SLE的診斷，監(jiān)控與治療至關(guān)重要。衡量細胞免疫應(yīng)答的水平可通過檢測由免疫原體外刺激全血白細胞產(chǎn)生的細胞因子來衡量。雖然細胞因子能敏感地反映機體的細胞免疫反應(yīng)，但由于多種生理或病理因素均可影響細胞因子的釋放，所以細胞因子本身不具疾病特異性(PICC0LI，L., MERONI,V.，GENC0, F.，TAMAROZZI, F.，TINELLI, C.，F(xiàn)ILICE, C.& BRUNETTI, E.Serumcytokine profile by ELISA in patients withechinococcal cysts of the liver: astage-specific approach to assess their biological activity.Clin Dev Immunol,2012，483935.)。至今為止，國際上尚未實現(xiàn)以檢測細胞因子來診斷自身免疫性疾病(包括SLE)的實驗技術(shù)。診斷及監(jiān)控SLE是基于綜合臨床表現(xiàn)及實驗檢查的美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)的分類標(biāo)準(zhǔn)，臨床醫(yī)生在判斷該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的11項指標(biāo)時受主觀因素影響較大，診斷準(zhǔn)確性差，加上缺乏既敏感及特異的實驗指標(biāo)，經(jīng)常出現(xiàn)誤診或漏診。而對SLE的治療基本上依賴各類免疫抑制劑，藥物副作用大，常引發(fā)繼發(fā)性感染。雖然近年來不斷涌現(xiàn)出新型的治療藥物(細胞因子拮抗劑)，臨床醫(yī)生對它們的選擇多依賴個人經(jīng)驗作主觀判斷，存在盲目性。而目前國際上仍缺乏能指導(dǎo)細胞因子個體化治療的實驗方法(KALUNIAN，K.& JOAN, T.Μ.New directions in the treatment of systemic lupus erythematosus.Curr Med ResOpin.2009.；R0NNBL0M, L & ELKONj Κ.B.Cytokines as therapeutic targets inSLE.Nat Rev Rheumatol, 2010，6，339-347.)。Smith (Sm)抗原已被證明是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)最特異的抗原。SLE病人體內(nèi)除了出現(xiàn)高特異的抗Sm抗體，還存在針對Sm抗原的特異性T細胞免疫反應(yīng)(FRITSCH-STORK, R.，MULLEGGER, D.，SKRINER, K.，JAHN-SCHMID, B.，SM0LEN,J.S.& STEINER, G.The spliceosomal autoantigen heterogeneous nuclearribonucleoprotein A2 (hnRNP-A2) is a major T cell autoantigen in patients withsystemic lupus erythematosus.Arthritis Res Ther, 2006, 8, R118.)。與雙鏈 DNA相比，Sm屬于蛋白抗原，具有能直接刺激T細胞活化增殖并釋放細胞因子的優(yōu)點。基于以上背景，本專利技術(shù)結(jié)合Sm抗原對SLE的高特異性及其能在體外直接刺激T細胞活化產(chǎn)生大量細胞因子的高敏感性，發(fā)展了一種新型的細胞免疫應(yīng)答體外檢測的實驗方法，用以輔助診斷SLE并為其治療和監(jiān)控提供參考。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于建立一種新型的細胞免疫應(yīng)答體外檢測方法，并用于SLE的輔助診斷和治療監(jiān)控。 本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下: 本專利技術(shù)利用Sm抗原能特異地刺激SLE患者T細胞活化并產(chǎn)生多種細胞因子的現(xiàn)象，首先篩選出這些能被T細胞特異識別的Sm合成肽，并將其混合作為體外刺激全血細胞的抗原。基于SLE患者全血中的記憶性T細胞能快速而特異地識別Sm抗原并活化產(chǎn)生細胞因子，本專利技術(shù)將待檢血液與Sm混合肽抗原混合培養(yǎng)時間控制在18-24小時(37°C )。然后檢測培養(yǎng)血上清液中特定細胞因子的水平，以判斷機體對特異性抗原的細胞免疫應(yīng)答能力以及患者的整體細胞免疫功能狀況。實驗同時設(shè)定本底對照(只加生理鹽水)及陽性對照(絲裂原:植物血凝素(PHA))。其中，用于刺激外周血的Sm混合肽抗原包含五條合成肽，由FMOC固相合成方法自動或人工合成，經(jīng)HPLC分析和純化，抗原純度90%以上。具體氨基酸序列如下: Sml: RGNNIRYFILPDSLPLDTLLSm2:SHETVTIELKNGTQVHGTIT Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMTSm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCISm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM 本實驗檢測的結(jié)果可有多種臨床用途:1.通過測定待檢血經(jīng)Sm混合肽刺激產(chǎn)生IL-6的含量，判斷患者對Sm抗原的刺激是否存在高水本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種新型的細胞免疫應(yīng)答體外檢測方法，其特征在于包括以下步驟：（1）篩選并混合能被T細胞特異識別的Smith(Sm)合成肽，作為刺激待檢外周血白細胞的抗原，同時設(shè)立絲裂原PHA作陽性對照；（2）將待檢血液與抗原混合，37℃培養(yǎng)20?24小時；（3）檢測培養(yǎng)血上清液中特定細胞因子的水平，以判斷機體對特異性抗原Sm混合肽和非特異性免疫原絲裂原PHA的細胞免疫應(yīng)答水平。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種新型的細胞免疫應(yīng)答體外檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (1)篩選并混合能被T細胞特異識別的Smith(Sm)合成肽，作為刺激待檢外周血白細胞的抗原，同時設(shè)立絲裂原PHA作陽性對照； (2)將待檢血液與抗原混合，37°C培養(yǎng)20-24小時； (3)檢測培養(yǎng)血上清液中特定細胞因子的水平，以判斷機體對特異性抗原Sm混合肽和非特異性免疫原絲裂原PHA的細胞免疫應(yīng)答水平。2.如權(quán)利要求1所述的細胞免疫應(yīng)答體外檢測方法，其特征在于:所述的Sm混合肽抗原包含五條合成肽，分別為Sml、Sm2、Sm3、Sm4、Sm5 ,具體氨基酸序列如下:Sml: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL ；Sm2:SHETVTIELKNGTQVHGTIT ；Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT ；Sm4:TVGKSSKMLQHIDYR...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳仁奮，魏秀妹，
申請(專利權(quán))人：陳仁奮，
類型：發(fā)明
國別省市：福建;35
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