一種人血清蛋白無機質譜聯用技術的定量方法技術

本發明專利技術公開了一種人血清蛋白無機質譜聯用技術的定量方法，包括：待測樣品首先進入高效液相色譜儀對血清蛋白進行分離；34S和54Fe同位素稀釋劑與高效液相色譜儀的洗脫液在線混合后進入電感耦合等離子體質譜儀檢測，通過硫元素對人血清中轉鐵蛋白、白蛋白進行絕對定量，并對轉鐵蛋白進行硫、鐵元素共同準確定量。本發明專利技術具有操作簡便、液相分離效果好、定量結果準確可靠、重現性好等優點，彌補了目前蛋白質定量技術里蛋白標準物質匱乏、蛋白定量偏差大的不足，填補了目前國內無機質譜技術對基體樣品中混合蛋白同時、多方式絕對定量方法的空白，為不同基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的絕對定量提供了新的思路和手段。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了，包括：待測樣品首先進入高效液相色譜儀對血清蛋白進行分離；34S和54Fe同位素稀釋劑與高效液相色譜儀的洗脫液在線混合后進入電感耦合等離子體質譜儀檢測，通過硫元素對人血清中轉鐵蛋白、白蛋白進行絕對定量，并對轉鐵蛋白進行硫、鐵元素共同準確定量。本專利技術具有操作簡便、液相分離效果好、定量結果準確可靠、重現性好等優點，彌補了目前蛋白質定量技術里蛋白標準物質匱乏、蛋白定量偏差大的不足，填補了目前國內無機質譜技術對基體樣品中混合蛋白同時、多方式絕對定量方法的空白，為不同基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的絕對定量提供了新的思路和手段。【專利說明】
本專利技術涉及蛋白質定量分析領域，更進一步說，涉及。
技術介紹
人血清中轉鐵蛋白及白蛋白的濃度水平與一些疾病息息相關，如血清轉鐵蛋白濃度在機體受到急性或慢性感染時降低，而在缺鐵性貧血和妊娠末期，轉鐵蛋白含量增高。血清白蛋白的濃度可以反映肝臟是否受損及受損的嚴重程度，同時白蛋白濃度水平的改變還能引起一系列的病理性繼發癥。因此對人血清中轉鐵蛋白及白蛋白的定量分析研究是探索疾病發生發展狀況的重要手段。目前蛋白質定量技術中比較成熟的方法多是基于同位素標記的生物質譜(如電噴霧電離質譜、基質輔助激光解吸質譜)分析技術，但是生物質譜的信號響應與蛋白質含量關系復雜，需要已知豐度的純蛋白進行歸一化處理，才能對蛋白質定量。然而，由于蛋白質種類繁多，并不是所有蛋白都有商品化產品，必須花費很長時間純化、制備各種純蛋白。不同與生物質譜，電感耦合等離子質譜(ICP-MS)是一種“硬”電離模式，樣品被等離子體的高溫(6000?10000K)尚子化成正尚子并在真空系統中按照質荷比分尚，信號響應與原子所處的分子環境無關，特別適合復雜體系中痕量或微量元素的定量。利用ICP-MS聯用技術對蛋白質中的元素定量，是近年來蛋白質定量技術研究的熱點。其中高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-1CP-MS)聯用定量蛋白質的研究較多，而且為保證定量的準確性，需要使用與待測蛋白匹配的標準物質保障質控和量傳，然而目前可獲得的純蛋白十分有限，常采用hplc-1cp-ms結合同位素稀釋法來解決這一難題。同位素稀釋法(ID)主要分為特異性形態及非特異性形態。前者的稀釋劑在前處理過程中加入到待測樣品里，定量結果不受實驗過程中樣品損失、形態變化、儀器漂移等因素影響，但是必須制備出與待測樣品匹配的特異性稀釋劑，直到2005年才第一次應用到蛋白質的絕對定量。非特異性形態同位素稀釋法(也稱柱后同位素稀釋法)，稀釋劑為某元素的濃縮同位素，基本都有商品化的產品，可實現不同基體蛋白質的定量分析。大部分蛋白質中均含有甲硫氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸，因此硫(S)是最適合作為蛋白質定量分析的元素。ICP-MS測定出蛋白質中硫的含量，再根據蛋白質氨基酸序列確定的硫原子個數，就可以對蛋白質進行定量分析。但是，目前報道的ICP-MS測量硫最大的難題是16O2+等對硫的譜線干擾，需要使用碰撞/反應池技術或高分辨質譜來解決，因此通過測定硫來定量的蛋白質主要是純蛋白，涉及到基體蛋白質定量的還很少。而且高效液相色譜-柱后同位素稀釋質譜法(HPLC-1D-1CP-MS)對基體蛋白質的定量分析大部分通過測定金屬元素，如Fe、Cu、Zn、Sn等進行，還未見到硫、鐵共同定量轉鐵蛋白的比較以及基體樣品人血清里轉鐵蛋白、白蛋白通過硫元素的同時定量分析。
技術實現思路
為解決現有技術中出現的問題，本專利技術提供了。通過強陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜同位素稀釋法(HPLC-1D-1CP-MS)絕對定量人血清中混合蛋白的方法。本專利技術具有操作簡便、液相分離效果好、定量結果準確可靠、重現性好等優點，彌補了目前蛋白質定量技術里蛋白標準物質匱乏的不足，適用于不同基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的絕對定量。本專利技術的目的是提供。包括:待測樣品首先進入高效液相色譜儀對血清蛋白進行分離；34S和54Fe同位素稀釋劑與高效液相色譜儀的洗脫液在線混合后進入電感耦合等離子體質譜儀檢測，通過硫元素對人血清中轉鐵蛋白、白蛋白進行絕對定量，并對轉鐵蛋白進行硫、鐵元素共同準確定量。具體步驟包括:(I)待測樣品的前處理過程:包括人血清標準物質的重構及血清樣品的富集；(2)樣品檢測:待測樣品進樣進入高效液相色譜儀進行測定，對血清蛋白進行分離；34S和54Fe同位素稀釋劑通過泵加入，與高效液相色譜儀的洗脫液在線混合后進入電感耦合等離子體質譜儀檢測；(3)定量計算:將整個色譜分離過程中質譜得到的同位素比值譜圖轉化為質量流譜圖，積分相應蛋白質的峰面積可得到元素的絕對含量，結合液相進樣體積及蛋白質所含元素個數，計算出蛋白質的絕對濃度。其中，34S和54Fe同位素稀釋劑流速在高效液相色譜儀洗脫待測樣品的O?15min為0.01?0.05mL/min,在15?30min流速增加到0.08?0.30mL/min ；34S同位素稀釋劑濃度為2?8 μ g/g, 54Fe同位素稀釋劑濃度為0.1?0.6 μ g/g。高效液相色譜條件:流動相A 為 20mmol/Kg Tris-HCl (pH8.6), B 為 A+500mmol/Kg甲酸銨溶液，使用前經過0.22 μ m有機相微孔濾膜過濾；流速0.6?1.0mL/min,時間程序為30min里B相由0%增加到100% ;進樣體積10 μ L，自動進樣；紫外檢測器檢測波長為280nm ；電感耦合等離子體質譜儀條件:功率1200?1300W，樣品氣流速1.0O?1.50L/min,輔助氣流速0.80?1.20L/min,冷卻氣流速15?17L/min，分辨率m/ Δ m=4000,掃描次數 700X1。本專利技術具體可采用以下技術方案:I)、HPLC-1D-1CP-MS 聯用系統:液相色譜儀HPLC:日本Shimadzu公司液相色譜系統，含LC-30AD高壓液相泵，SIL-30AC自動進樣器，CT0-20A柱溫箱，SPD-20A紫外檢測器。采用Shodex QA-825IEC(8.0mmX75mm)強陰離子交換柱為色譜柱。同位素稀釋法ID:同位素稀釋劑34S、54Fe混合溶液由液相泵LC-20AD加入，與液相色譜的洗脫液經過三通混合后在線進入ICP-MS檢測。電感I禹合等離子體質譜儀ICP-MS:美國Thermo Fisher Scientific公司Element2扇形磁場電感稱合等離子質譜儀,配置低(m/ Am=300)、中(m/ Δm=4000)、高(m/Am=IOOOO) 3種固定分辨率，配有進樣系統，射頻發生器，等離子體系統，離子透鏡系統，真空系統，檢測器，氣路控制系統。2)、配制所需試劑:(I )、配置 25mmol/Kg Tris-HAc 緩沖液，500mmol/Kg Na2CO3溶液，IOmmoI/Kg FeCl3溶液。(2)、流動相:A 相:20mmol/Kg Tris-HCl (ρΗ8.6) ;B 相:A+500mmol/Kg 甲酸銨溶液，使用前經過0.22 μ m有機相微孔濾膜過濾。所有的試劑均是優級純，實驗用水均為超純水。3)、人血清標準物質及樣品的前處理過程:可采用本領域通常的前處理過程，本專利技術中，可優選按以下進本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人血清蛋白無機質譜聯用技術的定量方法，其特征在于所述方法包括：待測樣品首先進入高效液相色譜儀對血清蛋白進行分離；34S和54Fe同位素稀釋劑與高效液相色譜儀的洗脫液在線混合后進入電感耦合等離子體質譜儀檢測，通過硫元素對人血清中轉鐵蛋白、白蛋白進行絕對定量，并對轉鐵蛋白進行硫、鐵元素共同準確定量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：馮流星，張丹，王軍，熊金平，
申請(專利權)人：中國計量科學研究院，
類型：發明
國別省市：北京;11