本發(fā)明專利技術屬于生物醫(yī)學技術領域，具體的說是一種青環(huán)海蛇(Hydrophis?cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造體抗菌肽HC-15及其制備方法和應用。改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophis?cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15，其是直鏈多肽，含有15個氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點12.61。本發(fā)明專利技術改造抗菌肽HC-15具有廣譜高效的抗菌活性，此外具有分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單等有益特點。
【技術實現步驟摘要】
—種青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15及其制備方法和應用
本專利技術涉及一種抗菌肽及其制備方法和應用，具體涉及一種青環(huán)海蛇(Hydrophiscyanocinctus) 抗菌肽Hc-CATH改造體抗菌肽HC-15及其制備方法和應用。
技術介紹
Cathelicidins是一個具有多功能的抗菌肽家族，目前在哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類動物中均有發(fā)現。Cathelicidins具有廣譜高效的抗微生物活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性，而且對許多臨床耐藥細菌同樣具有作用。除此之外，cathelicidins還具有許多其他生物學活性，如對多種免疫細胞具有趨化作用、誘導肥大細胞脫粒和組織胺釋放、調節(jié)巨噬細胞轉錄、促進傷口愈合、誘導血管發(fā)生、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等。由于具有如此眾多的活性，cathelicidins—直是國際上研究的熱點。針對cathelicidins的藥用開發(fā)則蘊含著巨大的臨床治療藥物制備價值。隨著傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當使用，微生物耐藥性問題變得日益嚴重，在臨床上已經出現了大量能夠廣泛耐受傳統(tǒng)抗生素的微生物，已有的抗生素對這些病原微生物無能為力。抗菌肽是一類天然的具有抗微生物活性的多肽，大多數抗菌肽分子量小于10KD，富含堿性氨基酸殘基，能夠形成兩親性的結構。大部分抗菌肽的殺菌機制是通過靜電相互作用吸引并結合到帶負電的細菌細胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內容物的外泄，從而導致細菌細胞的死亡。由于作用方式的不同，抗菌肽介導的殺菌作用遠遠快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細菌產生耐受性。目前，國外有許多公司正在進行cathelicidins家族抗菌肽的研究開發(fā)，已有多種cathelicidins家族抗菌肽及其改造體進入臨床試驗階段。如牛Indolicidin改造體MB1-226用于治療中心導管導致的血液感染，已進入臨床IIIb期。牛Indolicidin改造體MX-594AN用于治療痤瘡感染，已進入臨床IIb期試驗階段。豬protegrin改造體Iseganan用于治療腫瘤患者口腔感染，已進入臨床I期試驗階段。海蛇屬于爬行綱蛇目眼鏡蛇科，一般生活于大陸架和海島周圍的淺水區(qū)，是一類海岸帶極具開發(fā)潛力的海洋經濟爬行動物。世界上約有50多種海蛇，中國有扁尾海蛇亞科和海蛇亞科共9屬15種。海蛇藥用在中國歷代醫(yī)書均有記載，其作為祛風燥濕、通絡活血、攻毒和滋補強壯等功效良藥,常用于風濕搏癥、四肢麻木、關節(jié)疼痛、擠癖惡瘡等癥。現代醫(yī)學研究表明:海蛇干具有抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、提聞免疫力等功能；海蛇膽具有顯著止咳，祛痰作用，用于咳嗽、哮喘等呼吸道疾病的治療；海蛇毒具有鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗腫瘤等活性。海蛇所具有的廣泛的藥學活性，表明其具有極大的藥用開發(fā)潛力。但是與陸地蛇相比，目前國內外對海蛇的研究十分滯后，只有為數不多關于海蛇分類、生態(tài)、毒液成分和傳統(tǒng)藥學應用的文章報道。然而對海蛇cathelicidins家族抗菌肽的研究目前國內外仍是一片空白。青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)屬于眼鏡蛇科海蛇亞科海蛇屬,在遼寧、山東、江蘇、浙江、福建、臺灣、廣東、廣西、海南等省區(qū)沿海均有分布。但是目前關于青環(huán)海蛇cathelicidins家族抗菌肽的研究還沒有報道。專利技術人將本專利技術的青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH改造體HC-15氨基酸全序列經NCBI蛋白質數據庫進行搜尋比對，未發(fā)現有任何相同多肽。
技術實現思路
本專利技術的目的在于一種青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH改造體抗菌肽HC-15及其制備方法和應用。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為:一種改造體抗菌肽,改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15，其是直鏈多肽，含有15個氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點 12.61。所述改造體抗菌肽為:纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸，且C-末端酰胺化。改造體抗菌肽的應用，所述改造體抗菌肽HC-15用于制備抗微生物藥物的用途本專利技術的有益效果在于:本專利技術根據青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列，利用分子改造方法設計Hc-CATH的改造體HC-15，該改造體具有廣譜高效的抗微生物活性，此外具有分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單等有益特點。【具體實施方式】下面用實施例來進一步說明本專利技術的實質性內容，但本專利技術的內容并不局限于此。實施例1制備抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-151、HC_15的制備方法:根據青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的氨基酸序列，利用分子改造方法設計Hc-CATH的改造體HC-15。用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱層析脫鹽。I1、分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)。II1、純化的HC-15用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。測定結果為:HC-15是青環(huán)海蛇抗菌肽Hc-CATH的一種變異體。HC-15是一種直鏈多肽，含有15個氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點12.61。HC-15全序列為:纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸，且C-末端酰胺化。[0021 ] 試驗例I抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15的抗菌活性1.HC-15抗菌活性檢測分別挑取保存于斜面上的試驗菌株(標準菌株及臨床分離菌株共25株)均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)平板上，將經過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的HC-15樣品溶液10 μ I,于37°C倒置培養(yǎng)18-20小時，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強。2.HC-15 最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration)測定:試驗菌株分別接種到MH液體培養(yǎng)基中(青島海博生物技術有限公司)，37°C振蕩培養(yǎng)到對數生長期，而后將培養(yǎng)至對數生長期的培養(yǎng)液用新鮮MH液體培養(yǎng)基稀釋到2X105cfu/mlo取1.9ml上述稀釋的細菌培養(yǎng)液，加入經0.22 μ m孔徑膜過濾的2mg/ml的HC-15樣品溶液0.1ml作為第一管，第一管混勻后取出Iml加入第2管中，依次倍比稀釋(參見表1)，自第9管吸出Iml棄去，第10管為對照管。表1稀釋方法本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種改造體抗菌肽，其特征在于：改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophis?cyanocinctus)抗菌肽Hc?CATH的改造體HC?15，其是直鏈多肽，含有15個氨基酸殘基，且C?末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點12.61。
【技術特征摘要】
1.一種改造體抗菌肽，其特征在于:改造體抗菌肽為青環(huán)海蛇(Hydrophiscyanocinctus)抗菌肽Hc-CATH的改造體HC-15，其是直鏈多肽，含有15個氨基酸殘基，且C-末端酰胺化，分子量1974.46Da，等電點12.61。2.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：王義鵬，張淑敏，謝則平，
申請(專利權)人：山東國際生物科技園發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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