本發明專利技術涉及中藥篩選方法，特別涉及一種通過端粒長度篩選抗衰老中藥的方法；人胚肺二倍體成纖維細胞，在叔丁基過氧化氫的作用下加速其衰老，制作衰老細胞模型；在造模后，使用各種選取的中藥濃縮復合物對細胞進行處理；處理結束后，提取細胞基因組DNA，檢測其端粒長度，根據結果判斷是否熱性藥物即具有抗衰老活性。???
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及篩選藥物的方法，特別涉及。
技術介紹
端粒是存在于真核細胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質復合體，它與端粒結合蛋白一起構成了特殊的“帽子”結構，能夠維持染色體的完整。端粒DNA是由簡單的DNA高度重復序列組成的，染色體末端沿著5’到3’方向的DNA鏈富含鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)兩種核苷酸。在酵母和人中，端粒序列分別為Cl - 3A/TG1 一 3和TTAGGG/CCCTAA，并有許多蛋白與端粒DNA結合。端粒DNA主要功能有:第一，保護染色體不被核酸酶降解；第二，防止染色體相互融合；第三，為端粒酶提供底物，解決DNA復制的末端隱縮，保證染色體的完全復制。端粒、著絲粒和復制原點是染色體保持完整和穩定的三大要素。同時，端粒又是基因調控的特殊位點，常可抑制位于端粒附近基因的轉錄活性(稱為端粒的位置效應，TPE)。在大多真核生物中，端粒的延長是由端粒酶催化的，另外，重組機制也介導端粒的延長。端粒酶與惡性腫瘤的關系非常密切。研究發現，在人類許多正常體細胞中檢測不到端粒酶活性，而幾乎所有的人類惡性腫瘤細胞中的端粒酶均呈現活性。代表性的研究是，Kim等利用高度敏感的TRAP-PCR方法，對代表人18種不同組織類型的具有永生性腫胞株的100個標本進行檢測，結果顯示其中98例呈端粒酶陽性，而22例正常組織標本端粒酶全部陰性；相似地，代表人12種組織學類型的102個腫瘤活檢標本，共中 90例呈端粒酶陽性，而50例正常體細胞端粒酶全部陰性。人端粒酶催化亞單位mRNA在大多數正常體細胞中不表達，但在原發性腫瘤、癌細胞系中卻高表達。同時，有報道稱大多腫瘤細胞在繁殖過程中由于端粒酶的作用而維持其最短長度，使細胞無法因為端粒的最終缺失而進入凋亡程序，因此腫瘤細胞的繁殖永無休止。許多人認為，端粒酶的異常激活是細胞癌變的重要一步。
技術實現思路
本專利技術提供一種新型篩選抗腫瘤中藥的方法， 技術方案 ，其特征在于按如下步驟實施 1、選取端粒酶陽性細胞:HeLa細胞，乳腺癌MCF-7細胞，白血病細胞U937，白血病細胞HL60，淋巴瘤細胞CA46 ； 2、含10%小牛血清的1640培養基培養腫瘤細胞，細胞于37°C、5%CO2培養箱中培養，待長滿90%以上時，棄去瓶中原有的培養基，用PBS清洗兩次，棄去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37°C培養箱中消化3min,轉入刻度離心管中IOOOrpm離心3min,再加入2ml新鮮完全培養基重懸后，Cell Counter計數； 3)將重懸后的細胞稀釋至5 X IO3Cel 1/ml，每孔加IOOul接種96孔細胞培養板，次日換含不同濃度藥物的培養基繼續培養72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12ul，于培養箱中繼續培養4h。然后于平板離心機中，3000rpm離心5min后，吸出孔中溶液，加入150ul/孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩lOmin，最后酶標儀上檢測570nm和630nm處的吸光度值，則每個孔的吸光度值即為A570-A630。每個濃度的吸光度值取三個平行孔的平均值。細胞增殖率為:(A實-A陰對)/ (A陰對-A空)。結果與對照組比較； 4、將重懸后的腫瘤細胞稀釋至5 X IO3CelΙ/ml，每孔加500ul接種24孔細胞培養板，次日換含不同濃度藥物的培養基繼續培養72h和96h后，分別取樣，使用PCR-free方法測定端粒酶的活性，(n=3)0有益效果； 1、由于端粒酶活性都遠遠高于普通細胞，因此端粒酶活性是早期癌癥檢測的其中一個指標。如果能夠證明寒涼屬性中藥材，可以抑制端粒酶的活性，那么，通過檢測病人的外周血細胞內的端粒酶活性，可以實現癌癥的早期診斷，進而通過某些寒涼屬性中草藥一致早期癌癥患者細胞內的端粒酶活性，增加患者的生存時間，甚至治愈癌癥。因此本項目研究成果對發展防癌抗癌的新醫學理論和治療手段，造福人類，有非常重要的現實意義。具體實施例方式實施例1 O體外實驗 試劑與細胞 a.樣品:寒性中藥10組 b.陽性對照中藥:端粒酶抑制劑小檗堿-黃連素，中等強度的端粒酶抑制劑，IC50值約為 35 μ mol/L); c.端粒酶陽性細胞:HeLa細胞(+ )，乳腺癌MCF-7細胞( + )，白血病細胞U937 ( + )，白血病細胞HL60 ( + )，淋巴瘤細胞CA46 ( + )。)細胞培養與消化傳代 含10%小牛血清的1640培養基培養腫瘤細胞，細胞于37°C、5% CO2培養箱中培養，待長滿90%以上時，棄去瓶中原有的培養基，用PBS清洗兩次，棄去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37°C培養箱中消化3min，轉入刻度離心管中IOOOrpm離心3min，再加入2ml新鮮完全培養基重懸后，Cell Counter計數。3) MTT法測定藥物對腫瘤細胞增殖的影響 將重懸后的細胞稀釋至5 X IO3CelΙ/ml，每孔加IOOul接種96孔細胞培養板，次日換含不同濃度藥物的培養基繼續培養72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12ul，于培養箱中繼續培養4h。然后于平板離心機中，3000rpm離心5min后，吸出孔中溶液，加入150ul/孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩lOmin，最后酶標儀上檢測570nm和630nm處的吸光度值，則每個孔的吸光度值即為A5 70-A630。每個濃度的吸光度值取三個平行孔的平均值。細胞增殖率為:(八實-八陰對)/ (A陰對-A空)。結果與對照組比較。4)腫瘤細胞中端粒酶活性的測定 將重懸后的腫瘤細胞稀釋至5 X IO3CelΙ/ml，每孔加500ul接種24孔細胞培養板，次日換含不同濃度藥物的培養基繼續培養72h和96h后，分別取樣，使用PCR-free方法測定端粒酶的活性，(n=3)，方法同上，此處略。2)體內實驗 a)寒性中藥提取物對S18(l、H22和EAC動物移植瘤的影響 本實驗使用環磷酰胺(CTX)作為陽性對照；小鼠為昆明系小鼠，雌性，18-22g。 0對小鼠移植瘤S18Q、H22的抑制作用 取接種7 d生長良好的S18(l、H22小鼠，無菌條件下用注射器抽取腹水，以滅菌的生理鹽水1:4稀釋，調節細胞數為2.5X10個/ mL，取0.2 mL接種于小鼠右側腋窩皮下。接種24h后稱重，隨機分為中藥提取物高劑量組(1.2 g / kg)、中劑量組(0.6 g / kg)、低劑量組(0.3 g / kg)、CTX組(20 mg / kg)和空白對照組5組，每組10只。小鼠分別每天灌胃給藥I次，每次0.4 mL，空白對照組灌胃等量的生理鹽水，CTX組腹腔注射，連續給藥10 d，每3d稱體重I次，第11 d處死全部小鼠，剝取腫瘤稱重，計算抑瘤率，重復實驗一次，以t檢驗方法進行統計學處理。0艾氏腹水瘤小鼠生存期的實驗觀察 取接種7天生長良好的EAC小鼠，在無菌操作下用注射器抽取腹水，以滅菌的生理鹽水稀釋，調細胞數為2.0X 10個/ mL，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。接種24 h后稱重，隨機分為中藥提取物高劑量組(1.2g / kg )、中劑量組(0.6 g / kg)、低劑量組(0.3 g / kg),CTX組(20 mg / kg)和空白對照組5組，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
通過端粒酶篩選抗癌中藥的方法，其特征在于按如下步驟實施A、選取端粒酶陽性細胞：?HeLa細胞，乳腺癌MCF?7細胞,?白血病細胞U937，白血病細胞HL60，淋巴瘤細胞CA46；B、含10%小牛血清的1640培養基培養腫瘤細胞，細胞于37℃、5%?CO2培養箱中培養，待長滿90%以上時，棄去瓶中原有的培養基，用PBS清洗兩次，棄去，加入2ml?0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培養箱中消化3min，轉入刻度離心管中1000rpm離心3min，再加入2ml新鮮完全培養基重懸后，Cell?Counter計數；C、?將重懸后的細胞稀釋至5×103cell/ml，每孔加100ul接種96孔細胞培養板，次日換含不同濃度藥物的培養基繼續培養72h后，每孔加入5mg/ml?MTT溶液12ul，于培養箱中繼續培養4h；然后于平板離心機中，3000rpm離心5min后，吸出孔中溶液，加入150ul/孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩10min，最后酶標儀上檢測570nm和630nm處的吸光度值，則每個孔的吸光度值即為A570?A630；每個濃度的吸光度值取三個平行孔的平均值；細胞增殖率為：（A實?A陰對）/（A陰對?A空）；結果與對照組比較；D、將重懸后的腫瘤細胞稀釋至5×103cell/ml，每孔加500ul接種24孔細胞培養板，次日換含不同濃度藥物的培養基繼續培養72h和96h后，分別取樣，使用PCR?free方法測定端粒酶的活性，（n=3）。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：葉亞東，路易斯伊格納羅，張娟，全利，郝小江，朱兆云，滕凌，朱文華，胡娟，肖慧，潘鸝，張俊，楊紫俊，
申請(專利權)人：常州亞當生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。