本發(fā)明專利技術(shù)提供一種利用微生物方法轉(zhuǎn)化制備氧化白藜蘆醇的方法，將粉碎桑枝作為轉(zhuǎn)化底物投入發(fā)酵培養(yǎng)溶液中培養(yǎng)12~48小時，將得到的轉(zhuǎn)化液用質(zhì)量百分比濃度為60%~80%的甲醇或者乙醇溶液進行超聲提取，再靜止或離心處理去除下層雜質(zhì)沉淀，上清液回收溶劑，即得。此方法產(chǎn)物得率高，反應(yīng)條件溫和，安全無毒且成本低，操作簡單易于生產(chǎn)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物轉(zhuǎn)化
,特別是一種利用黑曲霉(Aspergillus niger)轉(zhuǎn)化技術(shù)制備氧化白藜蘆醇的安全、高效、快速的方法。
技術(shù)介紹
氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol)是羥基化的白藜蘆醇結(jié)構(gòu)類似物，較早的由北海道大學的S.Mongolsuk, Alexander Robertson, R.Towers等人在滇菠蘿蜜中發(fā)現(xiàn),而后在桑科植物中，百合科以及麻藤科植物中也陸續(xù)出現(xiàn)了它的身影。雖然相較于白藜蘆醇它的自然資源顯得十分有限，但是它卓越的藥用醫(yī)療、食品保健價值好似一筆巨大的寶藏，促使大量研究者們的擠上探索這個寶藏的偉大航路。隨后在1998年以及2007年等研究報告中發(fā)現(xiàn)氧化白藜蘆醇是絡(luò)氨酸酶的抑制齊U，可作為高效的美白化妝品添加劑。2003年以及2011年，研究者們通過動物實驗發(fā)現(xiàn)氧化白藜蘆醇表現(xiàn)出比熟知的抗氧化劑衍生物以及抗壞血酸更有效的DNA保護作用，具備十分優(yōu)良的抗氧化以及抗衰老作用(抗自由基)，表明氧化白藜蘆醇可作為抗衰老劑和核黃素穩(wěn)定劑潛在利用價值。2004年、2006年以及2008年等研究中又發(fā)現(xiàn)氧化白藜蘆醇卓越的神經(jīng)保護作用，或可開發(fā)成治療帕金森綜合癥的藥物以及預防老年癡呆以及中風等此類病癥發(fā)生的保健食品。2011年朱拉隆功大學通過小鼠實驗研究證明當運用氧化白藜蘆醇作為乳液主要的基礎(chǔ)成分時，可以治療皮膚單純皰疹病毒感染。氧化白藜蘆醇的生物活性遠不止這些，如近年來華工理工大學就以氧化白藜蘆醇具備有效治療及預防糖尿病及其并發(fā)癥的用途向國家知識產(chǎn)權(quán)局申請了一項專利技術(shù)專利，除此之外，氧化白藜蘆醇還具有抗癌、護肝、抗炎等諸多有利于人類健康的藥用效果。`氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol)比桑皮苷A (mulberroside A)多兩個酌■輕基，是它的桑皮苷A的苷元。QIUE報道，桑皮苷A通過實驗小鼠代謝后生成的氧化白藜蘆醇，生物活性更強。同時，Jeong-Ha Kim 等在專利(Application# =20060216253, Class =424062000(USPTO))中報道，從桑白皮(桑樹根根皮)中提取分離桑皮苷A時，所得到的最終產(chǎn)物中檢測到了少量氧化白藜蘆醇。目前獲得氧化白藜蘆醇的主要方法主要是用乙醇浸提桑白皮，再用硅膠、凝膠、聚酰胺等反復柱層析。這些方法過程繁瑣，得率純度偏低，更重要的是它至提取分離得到了桑樹中已經(jīng)存在的少量氧化白藜蘆醇，其含量較低。而桑白皮中的桑皮苷A含量遠遠高于氧化白藜蘆醇，造成了很大的生物能源浪費。西南大學徐立等人在專利(CN101591680)題名為氧化白藜蘆醇的提取方法中利用直接酶對桑皮(桑枝)提取，繼而對高含量的桑皮苷A進行了完全轉(zhuǎn)化，大大增加了其含量。但由于酶的價格昂貴、且不易獲得等缺陷，造成實際生產(chǎn)中的諸多不便。若通過安全易得的微生物方法轉(zhuǎn)化桑皮苷A，不但可以簡單、高效的快速提高提取物的收率，并且成本大大的降低，目前并無相關(guān)研究報道。專利技術(shù)的優(yōu)點在于可大大提高植物中氧化白藜蘆醇的得率，轉(zhuǎn)化率為70、8%。相對于傳統(tǒng)的化學法或從植物中直接提取的方法具有以下優(yōu)點:1、有害物質(zhì)含量低，安全無毒副作用；2、可進行大規(guī)模的應(yīng)用，不受季節(jié)環(huán)境等影響；3、生產(chǎn)操作簡便，產(chǎn)品得率高；4、成本低，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種利用微生物方法轉(zhuǎn)化制備氧化白藜蘆醇的方法。主要通過微生物與桑枝粉末共同發(fā)酵方法將桑枝中高含量的桑皮苷A徹底轉(zhuǎn)化為氧化白藜蘆醇，從而提高氧化白藜蘆醇的得率。該微生物是黑曲霉菌(Aspergillus niger)。本專利技術(shù)制備氧化白藜蘆醇的微生物轉(zhuǎn)化方法，包括: (1)、將黑曲霉菌(Aspergillus niger),進行常規(guī)培養(yǎng)活化，活化后的菌株做為生物催化劑；活化所用的斜面培養(yǎng)基為:馬鈴薯(PDA)斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂粉1.5°Γ2%, pH自然。121°C高壓濕熱滅菌，2(Γ30分鐘，滅菌后冷卻，制成斜面、接種黑曲霉進行活化。28°C培養(yǎng):Γ5天。(2)、取鮮桑枝或桑根的皮，粉碎至2(Γ40目，作為生物轉(zhuǎn)化底物，再將其添入發(fā)酵培養(yǎng)溶液；發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:桑枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。pH值為3飛。(3)、將(I)收集的菌體制成菌懸液，加入含(2)的底物的發(fā)酵溶液中并在一定條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成氧化白藜蘆醇；發(fā)酵培養(yǎng)條件為:250ml三角瓶裝液量5(Tl00ml，培養(yǎng)溫度為3(T45°C，搖床轉(zhuǎn)速為75 180r/min，接種量為:1% 3%，培養(yǎng)12 48小時。(4)、將( 3)的轉(zhuǎn)化液，用質(zhì)量百分比濃度為609Γ80%的甲醇或者乙醇溶液進行超聲提取10飛0分鐘，再靜止或離心處理去除下層雜質(zhì)，上清液回收溶劑，得到氧化白藜蘆醇粗品。(5)、根據(jù)氧化白藜蘆醇光不穩(wěn)定性的特征，發(fā)酵過程中采取必要的避光的措施，減少氧化白藜蘆醇的損失。最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件為:250ml的三角瓶裝液量50ml、培養(yǎng)溫度為45°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，接種量為3%，轉(zhuǎn)化時間為18.5小時。在此方法下能有效的提高桑枝氧化白藜蘆醇的得率，其桑皮苷A轉(zhuǎn)化率達到95%以上。所得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用高效液相法測定，其液相條件為:色譜柱:HyperSil BDS C18柱(4.6mmX 200mm, 5Mm);流速:lml/min ;柱溫為40°C ;流動相:1%甲酸水_乙腈，梯度洗脫程序為:0-20min，乙腈:甲酸水 5%: 95%，20_35min,乙腈:甲酸水一5%: 95% 20%: 80% ;檢測波長:320nm ;進樣量:20μ 。具體實施例方式實施例1 將新鮮采取的桑枝利用中藥粉碎機打粉過20目篩得到過篩粉末。斜面培養(yǎng):培養(yǎng)基為100ml，馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g，pH6，121 °C濕熱滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉(Aspergillus niger), 28°C培養(yǎng)4天，作為斜面培養(yǎng)基活化菌種。種子培養(yǎng)和發(fā)酵:培養(yǎng)基為枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。pH值為6.0，裝液量為250ml三角瓶裝液量100ml, 121 °C濕熱滅菌，作為發(fā)酵培養(yǎng)液。滅菌后冷卻接種斜面種子制成的菌懸液，接種量為l%，75rpm/min，30°C作為發(fā)酵條件。轉(zhuǎn)化液用60%甲醇超聲提取40分鐘后，離心去除沉淀，上清液過有機微孔濾膜后進HPLC，高效液相法在25小時時測得此次氧化白藜蘆醇的得率為4.9Pg/ml，算出最高轉(zhuǎn)化率為48%。實施例2 將新鮮采取的桑枝利用中藥粉碎機打粉過20目篩得到過篩粉末。斜面培養(yǎng):培養(yǎng)基為100ml，馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g，pH6，121 °C濕熱滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種，菌種為黑曲霉(Aspergillus niger), 28°C培養(yǎng)5天，作為斜面培養(yǎng)基活化菌種。種子培養(yǎng)和發(fā)酵:培養(yǎng)基為枝粉末1_2%、可溶性淀粉2-4%、蛋白胨0.5-1.5%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.4%、硫酸銨0.4%。pH值為5.0，裝液量為250ml三角瓶裝液量10本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種微生物轉(zhuǎn)化制備氧化白藜蘆醇的方法，其特征包括：（1）將黑曲霉菌株SW?3301進行常規(guī)培養(yǎng)活化，活化后的菌株做為生物催化劑；（2）取鮮桑枝或桑根的皮，粉碎至20~40目，作為生物轉(zhuǎn)化底物，再將其添入發(fā)酵培養(yǎng)溶液；（3）將（1）收集的菌體制成菌懸液，加入到步驟（2）含底物的發(fā)酵液中并在一定條件下進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成氧化白藜蘆醇；（4）將步驟（3）的轉(zhuǎn)化液，用質(zhì)量百分比濃度為60%~80%的甲醇或者乙醇溶液進行超聲提取后，再靜止去除下層雜質(zhì)，得到的上清液蒸發(fā)回收溶劑，得到氧化白藜蘆醇粗品。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李順祥，虢小翊，周晉，
申請(專利權(quán))人：湖南中醫(yī)藥大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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