本發明專利技術公開了豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因及重組巨大芽孢桿菌菌株和應用。本發明專利技術提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒Sad序列與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列連接在一起后得到的抗原融合基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示。本發明專利技術進一步提供了含有該抗原融合基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組巨大芽孢桿菌菌株。將本發明專利技術的重組巨大芽孢桿菌菌株用木糖進行誘導，抗原融合基因可以在該細菌細胞壁的表面進行表達。免疫印跡實驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發生反應，表明本發明專利技術重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，可將其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的重組菌株，尤其涉及豬傳染性胃腸炎病毒抗原融合基因以及含有該抗原融合基因的表達載體，本專利技術進一步涉及含有該表達載體的重組巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)菌株以及它們在制備防治豬傳染性胃腸炎疫苗中的用途，屬于豬傳染性胃腸炎的防治領域。
技術介紹
豬傳染性胃腸炎是由傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritisvirusof swine, TGEV)所引起的以嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。TGEV主要存在于空腸和十二指腸，各種日齡的豬均易感。由于仔豬自身抵抗力比較差，易受外界各種刺激因素的影響和病原微生物的侵襲，常會因嚴重脫水而發生死亡，并以2周齡以內的仔豬死亡率最高，可達100%。隨日齡的增大，雖然其死亡率逐漸下降，但感染該病的豬生產性能下降，飼料報酬率低，給世界范圍內的養豬業都帶來嚴重的經濟損失。傳染性胃腸炎病毒主要通過腸道感染豬，具有明顯的腸道組織嗜性的特點，在抗TGEV感染免疫過程中除體液免疫和細胞免疫外，局部腸粘膜免疫系統發揮著不可替代的作用。常規的滅活疫苗和弱毒疫苗在防治該疾病中起到了積極作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些問題，譬如:滅活疫苗免疫原性差，不能有效誘導slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接種后的動物機體排散病毒、病毒毒力可能返強等，另外還必須通過注射途徑免疫。TGEV有三種主要結構蛋白，分別為磷酸化的核衣殼蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纖突蛋白S，其中S糖蛋白攜帶主要的B 淋巴細胞抗原決定族，并且可以介導細胞的吸附、中和抗體的產生等過程，可以提供有效的免疫保護作用。S蛋白含有A、B、C、D四個主要抗原位點，其中A、D位點能產生中和性抗體。TGEV感染具有明顯的嗜腸性，病毒粒子表面的纖突蛋白(S蛋白)與存在于腸上皮細胞頂膜的氨基肽酶(APN)的結合是感染發生的首要條件，粘膜免疫是本病特異性免疫應答的主要特征，腸道粘膜表面SIgA含量的高低直接決定臨床疾病的發生和疾病嚴重程度。針對豬傳染性胃腸炎發病的幾個特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑。口服免疫突出的優點是可有效地刺激腸道局部免疫細胞產生分泌型IgA，這尤其適應于腸道粘膜傳染病，但口服免疫需要克服免疫原在到達小腸粘膜之前被降解或滅活的可能。使用細菌病毒等活載體來傳遞完整無損的抗原成分解決了這個問題，目前有使用減毒細菌作為疫苗抗原的載體的報道，如沙門氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙門氏菌作為載體傳遞DNA疫苗可能存在毒力返強的危險，質粒DNA也可能會整合到宿主細胞基因組，引起調控細胞生長的基因紊亂、原癌基因和抑癌基因的表達失控、體細胞癌變、細胞轉型等一系列問題。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點的融合基因及其編碼的蛋白；本專利技術的目的之二是提供含有上述豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點的融合基因的重組表達載體；本專利技術的目的之三提供含有上述重組表達載體的重組宿主菌株。為了實現上述目的，本專利技術一方面提供了一種由豬傳染性胃腸炎病毒Sad序列與化膿鏈球菌細胞壁錨定序列(CWAm6)連接在一起后得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示。本專利技術將TGEV S蛋白中A、D抗原位點(Sad)和化膿鏈球菌細胞壁錨定序列(CWAm6)(以化膿鏈球菌M6蛋白的最后140個氨基酸為細胞壁錨定序列)連接起來，考慮到巨大芽孢桿菌使用密碼子的偏嗜情況，為了提高異源基因在宿主菌中的表達，并保證翻譯后的氨基酸不變的情況下，對稀有密碼子蘇氨酸(ACC)和異亮氨酸(ΑΤΑ)、精氨酸(AGG、CGA)等進行改變，但不改變其所編碼的氨基酸。對TGEV S蛋白A抗原位點上的3個甲基化位點(AAC-AAT, ATC-ATT, ACA-ACT)進行點突變。通過兩個柔性的 Linker ((GGGGS) 3)將 TGEV 的 A、D抗原位點基因和細胞壁錨定序列(CWAm6)連接起來(順序為D-Linker-A-Linker-CWAM6)，本專利技術把該序列命名為MLS (SEQ ID N0.1)。其中，在MLS的上游和下游分別引入Bgl II酶切位點和SphI酶切位點。本專利技術的另一 方面是提供由SEQ ID N0.1所示融合基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。本專利技術的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的重組表達載體，譬如，將本專利技術的SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因與表達載體pHIS1525進行連接，得到可以在巨大芽孢桿菌細菌的外表面表達抗原融合基因的分泌表達載體。由此，本專利技術的再一方面是提供一株表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組巨大芽孢桿菌，能夠用其制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本專利技術將SEQ ID N0.1所示融合基因與分泌表達載體pHIS1525進行雙酶切、連接并經原生質體轉化轉入巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) WH320細胞，獲得含有重組質粒的巨大芽孢桿菌命名為WH320-pHIS1525-MLS，其微生物保藏號是:CCTCCNo:M2011429 ;分類命名是:巨大芽孢桿菌 WH320-pHIS1525_MLS(Bacillus megateriumWH320-pHIS1525-MLS);保藏時間是:2011年11月27日；保藏單位是:中國典型培養物保藏中心；保藏地址是:中國武漢武漢大學。進一步的，本專利技術將重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525-MLS用木糖進行誘導，使重組蛋白在巨大芽孢桿菌細胞壁表面進行表達(表達約26KDa的重組蛋白)；免疫印跡實驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發生反應，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性，能夠用于制備成防治豬傳染性胃腸炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本專利技術構建了 WH320-pHIS1525-MLS表達載體系統，表達了含有TGEV蛋白A/D位點和化膿鏈球菌細胞壁錨定序列CWAM6連接序列MLS，目的蛋白約26kDa;免疫印跡試驗表明，所表達的重組蛋白能夠與TGEV免疫血清發生反應，表明重組蛋白與TGEV天然抗原一樣具有相同的抗原性。間接免疫熒光檢測也證實表達蛋白存在于菌體上，誘導表達后的活菌體免疫熒光試驗表明，所表達的蛋白初步定位于菌體的表面，存在菌體表面的目的蛋白，為抗原物質有效刺激免疫系統，提高抗體水平奠定了重要的物質基礎。本專利技術針對TGEV發生和免疫的幾個特點，在實驗設計上以阻斷腸道傳染病疾病病原感染的第一道防線為目的，使用安全無毒的巨大芽孢桿菌表達系統，巨大芽孢桿菌不產細胞內毒素，不產胞外堿性蛋白酶，有利于所表達蛋白的穩定積累，質粒穩定，可以穩定高效地表達蛋白，比較適合工業化發酵生產。同時芽孢桿菌在腸道定植后，能消耗大量的游離氧，造成厭氧環境，可減少需氧菌對腸道的定植。也有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長，致使體內的有益菌增加而致病菌減少，保持腸道微生態系統平衡。為了檢驗本專利技術重組巨大芽孢桿菌或該重組巨大芽孢桿菌所表達的融合蛋白MLS作為防治豬傳染性胃腸炎口服疫苗的可行性，本專利技術將構建的重組巨大芽孢桿菌WH320-pHIS1525-M本文檔來自技高網...
【技術保護點】
豬傳染性胃腸炎病毒主要抗原位點的融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：張金林，胡曉芬，
申請(專利權)人：武漢華揚動物藥業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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