一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株制造技術

本發(fā)明專利技術涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌病疫苗領域，公開了一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌（Haemophilus?parasuis），菌株號為FS0307，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:M2013094，保藏日期：2013年3月21日。本發(fā)明專利技術的血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株對豬有較強的致病性，具有良好的免疫原性，應用其制備的滅活疫苗安全可靠，對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護效果，免疫后豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少。無論是單苗還是聯(lián)苗，其免疫效果均達到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，能夠有效預防副豬嗜血桿菌的流行。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌病疫苗領域，特別是涉及一株血清4型副豬嗜血桿菌株。
技術介紹
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)為巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中的一種革蘭氏陰性球桿菌，是豬的一種條件性病原菌，呈世界性分布，感染仔豬后引起以多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征的豬格拉澤氏(Glasser’s)病。主要危害2 8周齡的仔豬，發(fā)病率一般為10% 15%，死亡率可達50%以上。副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求苛刻，生長嚴格需要V因子(NAD)，目前認為胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基與胰蛋白胨大豆(TSB)培養(yǎng)基是培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的最適培養(yǎng)基。在添加NAD的TSA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h可見針尖大小灰白色菌落，呈隆起圓形，表面光滑、濕潤、邊緣整齊。HPs在巧克力瓊脂平板上生長困難，有報道顯示，巧克力平板上HPs不能進行傳代培養(yǎng)，不適用于體外傳代培養(yǎng)，但巧克力瓊脂平板可以用于分離該菌，初次分離培養(yǎng)時供給5% 10%的二氧化碳(CO2)可促進生長。液體培養(yǎng)時需要在肉湯或TSB培養(yǎng)基中添加血清與V因子(NAD)，但添加V因子濃度不斷增加細菌濃度不會隨之升高。由于葡萄球菌生長過程中會將自身代謝產(chǎn)物V因子釋放到培養(yǎng)基中，所以HPs與金黃色葡萄球菌共同接種于鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，HPs在金黃色葡萄球菌兩側生長良好，隨著與金黃色葡萄球菌距離增加，菌落逐漸變小，該現(xiàn)象被稱為衛(wèi)星現(xiàn)象。HPs對外界環(huán)境抵抗力極弱，體外培養(yǎng)極易死亡。HPs菌株間抗原性和毒力差異很大，血清學分型是區(qū)別不同菌株的重要方法之一。目前，由Kielstein等1992年提出的基于熱穩(wěn)定抗原免疫擴散試驗的血清學分型方法(KRG)已在世界范圍內(nèi)被接受，該方法將HPs分成15個血清型，然而有15.2% 41%的分離株血清型不能確定。根據(jù)日本、德國、美國和西班牙等國的血清流行病學調查，以血清型4、5和13最為流行。HPs在我國普遍流行，目前,在河北、河南、湖北、湖南、安徽、上海、廣東、江西等12個省市均有副豬嗜血桿菌病發(fā)生和分離 出HPs的報道。由于獸醫(yī)臨床上常常大量甚至不合理使用抗菌藥，致使豬場細菌在藥物壓力下選擇出耐藥菌群。因此，用藥物防控副豬嗜血桿菌病的難度越來越大，而且隨著人們對食品安全問題的擔憂，抗生素在防控動物疾病方面的應用會更少，而將發(fā)揮更大作用的是相應的疫苗。HPs血清型較多，且不同血清型菌株的毒力與致病力差異較大，各個血清型之間免疫交叉保護力很低，所以，現(xiàn)有國內(nèi)外商品化的副豬嗜血桿菌病疫苗均不能對該病提供完全有效的保護。因此，分離篩選免疫原性強的通用型HPs菌株，并利用其制備高效疫苗是防控副豬嗜血桿菌病的重中之重。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株(FS0307株)，該疫苗株具有較強的毒力和很高的免疫原性。為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案如下:一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis),菌株號為FS0307,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址:中國.武漢.武漢大學，郵編430072，保藏編號:CCTCC N0:M2013094，保藏日期:2013年3月21日。該菌株是專利技術人于2003年4月于河北省衡水市自行采集篩選獲得一株具有較強的毒力和很高的免疫原性的菌株。上述血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株在制備治療豬副豬嗜血桿菌病藥物中的應用。其中，所述的藥物為疫苗，優(yōu)選油包水型疫苗、或水包油型疫苗、或水包油包水型疫苗。其中，血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株與藥學上可接受的載體或輔料組合構成藥物，如單價苗、多價苗或聯(lián)苗等等。其中，所述血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株在疫苗中含菌量為2X 109CFU/mL以上。有益效果:本專利技術的血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株具有穩(wěn)定的生物學特性，對仔豬有較強的致病性，且具有良好的免疫原性。應用其制備的油佐劑滅活疫苗安全可靠，能夠產(chǎn)生較高水平的抗體，持續(xù)期長，并且對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護效果，免疫后豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果均達到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，能夠有效預防副豬嗜血桿菌的流行。具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術。實施例1:血清4型副豬嗜血桿菌FS0307株的分離純化和鑒定。1.生產(chǎn)用培養(yǎng)基TSA固體培養(yǎng)基配制:準確稱取TSA粉末40g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121 °C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至50 60°C時，加入過濾除菌的牛血清50mL、IOmL過濾除菌的0.0P/oNAD,混合均勻后倒板備用。TSB液體培養(yǎng)基配制:準確稱取TSB粉末30g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121°C高壓蒸汽滅菌15min，臨用前加入過濾除菌的牛血清50mL、IOmL過濾除菌的0.01%NAD即可。2.副豬嗜血桿菌分離純化及鑒定2.1分離純化2003年，我國河北地區(qū)的某規(guī)模化豬場大量出現(xiàn)疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬，以持續(xù)發(fā)熱、胸膜炎、腹膜炎、關節(jié)炎等為特征，選取病豬的肺、胸水、心包液、關節(jié)液接種TSA/NAD固體培養(yǎng)基，置 37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時，挑取半透明隆起的小菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進行兩次TSA/NAD固體培養(yǎng)基亞克隆培養(yǎng)。同時接種鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基，結果TSA/NAD固體培養(yǎng)基上生長良好，鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基沒有菌落生成。2.2生化鑒定取純培養(yǎng)菌液接種TSA/NAD固體培養(yǎng)基，置37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時。觀察菌落形態(tài)，可見針尖大小，圓形，邊緣整齊，扁平，灰白色半透明隆起的小菌落。取單個菌落涂片革蘭氏染色，為革蘭氏染色陰性，呈多形性，為單個小球桿菌或細長的絲狀桿菌。將純培養(yǎng)菌液在脫纖綿羊鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基上與金黃色葡萄球菌作交叉劃線，置37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時后，呈小而透明的菌落，越靠近葡萄球菌附近生長越好，呈現(xiàn)出典型的衛(wèi)星生長現(xiàn)象，并且鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周圍不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。將純培養(yǎng)菌液接種于TSA/NAD固體培養(yǎng)基，再分別貼上浸潰有X、V、X+V因子的圓形濾紙片。置37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24 48小時，結果只有在含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長，表明該菌株只依賴V因子，而不依賴X因子。將純培養(yǎng)菌液接種微量生化反應管，分別補充終濃度0.01%的NAD，置37°C靜置培養(yǎng)，48h后判定生化特性結果。結果表明分離菌株對葡萄糖、蔗糖和果糖發(fā)酵，對麥芽糖、半乳糖、木糖和果糖不發(fā)酵，吲哚試驗、氧化酶試驗和脲酶試驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗和接觸酶試驗陽性,符合副豬嗜血桿菌的生化特性。根據(jù)該菌株的來源地將其命名為FS0307株。2.316S rRNA基因序列測定與分析2.3.1引物設計根據(jù)GenBank中副豬嗜血桿菌P5基因序列設計兩條引物，引物序列為:P1:5’ -gctccacaagctaacactttc-3J，P2:5’ -catagaaacttcttttgaac本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一株血清4型副豬嗜血桿菌疫苗株，其分類命名為副豬嗜血桿菌（Haemophilus?parasuis），菌株號為FS0307，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO:M2013094，保藏日期：2013年3月21日。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：邵國青，劉茂軍，周勇岐，
申請(專利權)人：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，
類型：發(fā)明
國別省市：