本發明專利技術公開了一種具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架及其制備方法，從仿生角度出發，為了更好的模擬天然骨組織中細胞外基質的組分、結構與功能，選用殼聚糖、膠原、透明質酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術結合原位復合方法制備類似天然骨細胞外基質的人工骨缺損修復支架。本發明專利技術制備程序簡單，工藝條件溫和，制備的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架在組成與結構上與天然骨基質類似，性能優越，具有可塑性，可被加工成所需要的形狀。
【技術實現步驟摘要】
一種具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架
本專利技術屬于骨組織修復支架材料制造領域，具體涉及一種具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架及其制備方法。
技術介紹
生物醫學材料的研究與開發對國民經濟和社會的發展具有十分重要的意義。近幾十年來，生物醫學材料的研究與開發取得了很大進展，使成千上萬的患者獲得了康復，大大提高了人類的生命質量。硬組織材料是生物醫學材料的重要組成部分，人體硬組織生物活性替代材料應具有行使替代部位的生理功能，如支撐作用或骨引導作用、能模擬人體骨的生長與吸收、參與植入部位的新陳代謝、與組織進行物質交換等。具有高度生物活性的人體硬組織替代材料一直是國內外學者研究的熱點。按照仿生學的原理，越是與機體相似的材料越是能夠被機體接納。研制一種與天然骨組織結構、性能相一致的骨替代材料，一直是骨組織工程材料研究的目標。天然骨是由無機和有機基質巧妙結合在一起形成的天然復合體，其中無機質大部分是羥基磷灰石(HAP)，有機質大部分是纖維性膠原蛋白和少量多糖。從廣義上說，它可近似看作以骨膠原為基體材料、羥基磷灰石為增強材料而構成的有機-無機復合材料?；诖?，膠原基納米羥基磷灰石類復合材料成為了近年來骨材料研究的熱點之一。但由于該類材料存在機械性能差和降解速率過快，無法與骨生長速度很好地匹配等缺點，使其難以單獨成為良好的骨組織工程支架。近幾年來，研究者們通過仿生合成、交聯處理、引入第三相等方法來提高膠原基納米羥基磷灰石復合材料的性能。殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚多糖，其結構與細胞外基質的主要成分一糖胺聚糖十分類似，降解產物對人體無毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。在外形方面，殼聚糖可制成管狀、膜、片、微粒等多種形狀的多孔材料，已廣泛應用于生物領域。殼聚糖的力學性能強于膠原，在體液環境中降解速率能滿足骨組織工程的需要，并且能和膠原很好的復合，增加膠原的穩定性。透明質酸(HYA)是細胞外基質中的一種重要天然多糖，具有高度含水能力，可以特異地與CD44受體結合，在調節細胞行為方面有重要作用。在膠原中復合透明質酸，可以利用其優越的生物功能，促進細胞分化與增殖，有助于得到新生組織?；诖?，本專利技術利用殼聚糖、透明質酸、膠原的分子交聯技術和納米羥基磷灰石的自組裝仿生學原理結合冷凍干燥相分離技術，在成分仿生的基礎上進行結構仿生制備類似天然骨組織細胞外基質的人工骨缺損修復支架。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架及其制備方法。本專利技術制得的三維立體多孔支架具有較大孔隙率和微米/納米多級孔徑結構，有利于細胞粘附生長、細胞外基質沉淀、營養與氧氣進入、代謝產物的排出；支架上含有細胞特異性識別位點，有利于細胞粘附、生長，更重要的是能激活細胞特異基因表達，維持正常細胞的表型表達。為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案: 從仿生角度出發，選用殼聚糖、膠原、透明質酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術結合原位復合方法，在成分仿生的基礎上進行結構仿生制備類似天然骨組織細胞外基質的人工骨缺損修復支架。多級孔徑結構是指納米復合骨缺損修復支架具有微米級、納米級的多級孔徑分布。一種制備如上所述的具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架的方法包括以下步驟: (1)將透明質酸溶解于去離子水中，殼聚糖和膠原溶解于體積分數為I 2%的乙酸溶液中； (2)緩慢將透明質酸溶液加入到殼聚糖/膠原的乙酸溶液中，攪拌0.5 lh，使其充分混合均勻； (3)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學計量比Ca/P= 1.67在步驟(2)的混合溶液中分別加入2 3mol/L可溶性鈣鹽溶液和1.2 1.8mol/L可溶性磷酸鹽溶液； (4)往步驟(3)的混合溶液中加入交聯劑，常溫交聯4 8h，最終混合液注入模具，移至2 4°C冰箱預冷凍3 5h，再放入-10 -80°C冷凍至少12h ； (5)將步驟(4)所得的冷凍樣品轉入冷凍干燥機中進行冷凍干燥至完全脫水； (6)將步驟(5)的干燥樣品置于0.5 1.5mol/L的堿溶液中浸泡8 15h,再用去離子水反復浸洗至中性，-10 _80°C冷藏后進行冷凍干燥，即得到具有多級孔徑結構的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架。步驟(3)所述的可溶性鈣鹽是硝酸鈣或氯化鈣，可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉。步驟(I)所述的膠原為I型活性膠原蛋白，透明質酸選用它的鈉鹽。步驟(3)的可溶性鈣鹽溶液和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔20 40min加入。步驟(4)所述的交聯劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS);交聯劑EDC的濃度為2 4mg/mL，NHS的濃度為I 3mg/mL。步驟(6)的堿溶液是0.5 1.5mol/L KOH或NaOH的乙醇/水(v: V=I 2:1)溶液。步驟(4)的最終混合液中，殼聚糖的濃度為16 20g/L，膠原的濃度為2.5 5 g/L，透明質酸的濃度為0.5 1.5 g/L，加入的Ca/P前驅體溶液理論形成HAP量為10 20g/L。本專利技術的顯著優點在于:殼聚糖在組成和結構上與糖胺聚糖具有部分相似性，且生物相容性好；透明質酸是一種糖胺聚糖，存在于細胞外基質中，具有保濕、促進離子溶質和營養物質運輸的功能，能通過與其他基質分子相互作用，保持細胞外基質的穩定性和彈性；膠原蛋白是細胞外基質的重要成分之一，本身含有RGD生物活性短肽，可特異性識別并與細胞表面整連蛋白受體鍵合，促進細胞 的黏附與生長。原位形成的羥基磷灰石類似人體內生物礦化生成的羥基磷灰石，無毒、安全、具有良好的生物相容性、骨傳導性。因此，選用殼聚糖/膠原/透明質酸為有機基質，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無機相納米羥基磷灰石的先驅物，采用冷凍干燥相分離技術原位構筑與人體骨組織細胞外基質相近的人工骨缺損修復支架，相對于其他骨缺損修復支架有以下優點: (1)納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)序列，可特異性識別并與細胞表面整連蛋白受體鍵合，促進細胞的黏附與生長; (2)納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架具有微米級、納米級的多級孔徑結構；這種多級孔徑結構有利于細胞的附著、鋪展、遷移，培養液和代謝產物的運輸及交換，從而有利于細胞生長； (3)采用原位復合的制備方法，使得羥基磷灰石在支架上實現了納米級分散，相界面的結合力得到加強，改善了支架的力學性能； (4)可以通過改變交聯劑的用量來控制交聯度，得到具有不同生物降解性能和力學性能的復合支架； (5)該復合支架的制備工藝條件溫和，操作方便。附圖說明圖1-3具有多級孔徑結構的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架的SEM掃描電子顯微鏡圖。圖4是具有多級孔徑結構的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架圖3的放大圖(箭頭所指是支架上的納米顆粒)。圖5是具有多級孔徑結構的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架上附著的納米粒的XRD衍射圖譜。圖6具有多級孔徑結構的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質酸骨缺損修復支架的Hoechst33258熒光染色圖本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架，其特征在于：從仿生角度出發，選用殼聚糖、膠原、透明質酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術結合原位復合方法，在成分仿生的基礎上進行結構仿生制備類似天然骨組織細胞外基質的人工骨缺損修復支架。
【技術特征摘要】
1.一種具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架，其特征在于:從仿生角度出發，選用殼聚糖、膠原、透明質酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術結合原位復合方法，在成分仿生的基礎上進行結構仿生制備類似天然骨組織細胞外基質的人工骨缺損修復支架。2.根據權利要求1所述的具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架，其特征在于:以殼聚糖、膠原、透明質酸為有機相，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無機相納米羥基磷灰石的先驅物。3.根據權利要求1所述的具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架，其特征在于:多級孔徑結構是指納米復合骨缺損修復支架具有微米級、納米級的多級孔徑分布。4.一種制備如權利要求1所述的具有多級孔徑結構的納米復合骨缺損修復支架的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將透明質酸溶解于去離子水中，殼聚糖和膠原溶解于體積分數為I 2%的乙酸溶液中； (2)緩慢將透明質酸溶液加入到殼聚糖/膠原的乙酸溶液中，攪拌0.5 lh，使其充分混合均勻； (3)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學計量比Ca/P= 1.67在步驟(2)的混合溶液中分別加入2 3mol/L可溶性鈣鹽溶液和1.2 1.8mol/L可溶性磷酸鹽溶液； (4)往步驟(3)的混合溶液中加入交聯劑，常溫交聯4 8h，最終混合液注入模具，移至2 4°C冰箱預冷凍3 5h，再放入-10 -80°C冷凍至少12h ； (5)將步驟(4)所得的冷凍樣品轉入冷凍干燥機中進行冷凍干燥至完全脫水； (6)將步驟(5)的干燥樣品置于0.5 1.5mol/L的堿溶液中浸泡8 15h,再用去離子水反復浸洗至中性，-10 _80°C...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳景帝，余其鳳，張惠，張玉玨，張其清，
申請(專利權)人：福州大學，
類型：發明
國別省市：
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