無菌斑馬魚的生產方法技術

本發明專利技術公開了一種無菌斑馬魚的生產方法。該方法包括如下步驟：1）將斑馬魚受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29℃培養3-8h；2）用所述AB-GZM溶液漂洗；3）用0.005g/L的聚維酮碘水溶液浸泡1-2min；4）用無菌GZM溶液漂洗；5）用漂白劑漂白10-20min；6）用所述無菌GZM溶液漂洗，漂洗后，將受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養，溫度為25-29℃，光周期為L10：D14至L14：D10；7）待胚胎孵化后，每天進行所述無菌GZM溶液的半量換液；從孵化后的斑馬魚中獲得無菌斑馬魚。本發明專利技術通過自然繁殖獲得斑馬魚受精卵，最終獲得無菌斑馬魚；本發明專利技術為研究微生物與斑馬魚之間的相互作用及多生物學進程提供了方便的材料，對進一步研究微生物和其脊椎動物宿主之間關系的內在機制也具有十分重要的參考意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種。
技術介紹
在1870年由巴斯德和科赫提出的細菌疾病理論極大的改變了我們的概念化，以及說明了我們與微生物的各種關系。細菌理論研究的成果在醫學和公共衛生方面有著意義深遠的進步，以及對微生物有一個廣泛的概念化，例如病原體。在宿主與微生物相互作用關系中，那種長期以病原體為中心的觀點會讓我們忽視這一個事實，即動物所遇到的大多數微生物并沒有引起明顯的疾病，并且可以被認為是與宿主在共生或者互利共生關系的移住民。這些微生物居民包括細菌，古細菌以及真核微生物，其中有許多不能在體外培養。在基因組時代，對非致病的宿主與微生物之間相互作用的研究讓我們受益巨大，并讓我們對這些微生物群落的組成和能力的認知顯著擴增。這項研究大主體已經建立，即動物微生物非致病成員在動物正常出生后的發育及生理方面發揮了顯著的作用，從體內免疫穩態到新陳代謝方面。此外，微生物群還和許多疾病的發病有關，包括過敏，炎癥性腸道疾病，癌癥以及肥胖。對宿主和其定植微生物之間分子交流的理解的提高使我們有希望找到促進人類和動物健康的新醫療策略。我們現在所知道的關于微生物群落如何有助于宿主的生物學和病理學都是從研究無菌動物所獲得的。無菌這個詞是來源于希臘詞語“gnosis”(knowledge)和“bios”(life)，并且指一種實驗環境即環境里所有的微生物都是確定的或者是沒有的。無菌實驗的建立是根據在沒有任何微生物條件下養殖動物的能力，用特定的微生物菌種在其體內定植或者更復雜的協作。無菌實驗的概念可以追溯到巴斯德，他在1885提出的假設即動物在沒有微生物的條件下是不可能存活的。這個假設僅在11年后就被推翻了，1896年Nuttal和Thierfelder用無菌剖腹產生產第一個無菌動物-豚鼠，并且養到13天。這一開始報導不久以后就成功生產出無菌小雞，山羊和一群其他動物，鳥類和兩棲動物。盡管這些早期的研究證實動物可以在沒有微生物的條件下存活，但是無菌脊椎動物連續的生產至始至終都沒有獲得成功，直到1940年Reyniers和他的同事在圣母大學以及Gustafsson和他同事在倫德大學才能獲得成功。無菌脊椎動物連續的生產的成功主要是由于在無菌動物營養學獲得關鍵的進展。雖然無菌動物的可行性推翻了巴斯德的假設，但是在一方面是對的，即沒有微生物情況下會影響動物生物學的許多方面。盡管大多數的無菌脊椎動物的研究都集中在哺乳動物和鳥類，但是也有人試圖在無菌條件下養殖魚類。Baker和Ferguson是第一次報導成功獲得無菌魚,卵胎生新月魚，在卵黃吸收后用殺菌飼料喂養可以存活幾周時間。在這一發現之后又成功獲得了無菌卵生羅非魚，多卵生鮭魚種類，多卵胎生花鏘科魚類和多卵生紅鱸。盡管這些開創性的報導證實無菌魚可以在一定時間內存活，但是他們不包括無菌魚的基本形態和生理特性，也沒有說明無菌魚的特定營養需求， 也沒有評估用微生物在無菌魚定植的結果，也不能獲得生長到性成熟的無菌魚。在過去的三十年里，斑馬魚已經成為一個重要的基礎和生物醫學研究的模式動物。斑馬魚卵是在體外受精的，這導致胚胎在孵化成為自由生活幼魚之前一一受精后3天是在它的保護膜內發育的。斑馬魚幼魚開始進食是在受精后5天，以及幼體魚到成魚的變態發育是在受精后14天開始。斑馬魚具有額外的吸引性特征來分析宿主和微生物之間的相互作用，包括豐富的遺傳學背景和基因資源，在發育過程中光透明特性允許我們在體內觀察宿主和微生物細胞，并且可以控制進一步基因篩選(宿主和微生物都可以)和化學篩選。這些屬性，結合斑馬魚和哺乳動物基因組，解剖水平和生理水平之間有廣泛的同源性，讓斑馬魚作為人類生物學和病理學一個有用的模式動物。無菌動物模式便于分子一系列的參數，首先，無菌動物可以用于研究微生物如何定植或者微生物代謝產物如何影響宿主生物進程，包括基因表達，發育，生理，免疫和壽命。這可以使無菌動物在特 定時間點暴露在個別菌種，特定的微生物或者產物然后分析宿主的反應來完成。宿主的功能和微生物的基因產物可以通過在相應的菌種進行基因操作來檢測。第二，無菌動物是一個非常好的平臺去研究微生物與微生物之間的相互作用在活體宿主的生理環境內。我們可以用確定的微生物種類或者基因型組合讓它們定植在無菌宿主體內，然后就可以用培養或DNA序列檢測微生物群落在活體內之間的競爭。這些宿主與微生物以及微生物和微生物之間的相互作用可以作為一個函數用來分析微生物基因型，群落競爭，宿主基因型，宿主發育階段，宿主生理,宿主體內定植微生物的歷史,解剖學定位,飲食和其他環境和生理參數。除了無菌斑馬魚和無菌哺乳動物之間這些實驗技術是共享的，斑馬魚還有著獨特的優勢，所以斑馬魚應該在無菌生物學領域受到重視。其中一個優勢是斑馬魚在發育的早期特性的光透明性允許我們觀察宿主活體細胞，微生物細胞以及分子事件。盡管只能在光學亮視野內觀察活斑馬魚的細胞和微生物的細胞，但是這些研究可以通過用宿主或者微生物的基因工程改造特定的調節序列去表達報告熒光蛋白來增強。此外，外界提供的熒光探針可以在體外或體內檢測特定的細胞型和生物學進程。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種。本專利技術所提供的，具體可包括如下步驟:(I)將斑馬魚受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29°C，且溫差小于0.5°C的條件下培養3-8h ；(2)將步驟(I)處理后的所述受精卵用所述AB-GZM溶液進行漂洗；(3)將步驟(2)漂洗后的所述受精卵置于濃度為0.005g/L的聚維酮碘水溶液中，浸泡l-2min (注意:不能超過2min，否則會增加胚胎死亡率)；(4)將步驟(3)浸泡后的所述受精卵用無菌GZM溶液進行漂洗；(5)將步驟(4)漂洗后的所述受精卵用漂白劑漂白10_20min，期間可輕輕搖晃幾次，使所述受精卵懸浮在所述漂白劑中，注意溶液不要有汽包；所述漂白劑為濃度為0.02g/L的次氯酸鈉水溶液。(6)將步驟(5)漂白后的所述受精卵用所述無菌GZM溶液進行漂洗，漂洗后將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養，培養溫度為25-29°C，光周期為LlO:D14至L14:D10,直至所述受精卵孵化得到幼體魚；(7)對所述幼體魚每天進行所述無菌GZM溶液的半量換液(即將舊的培養液去除一半體積，補充相應體積的新的所述無菌GZM溶液；同時注意第一次換液的時候須把卵膜吸出去以免影響水質)培養，直至所述幼體魚長成為目的大小的斑馬魚，從所述目的大小的斑馬魚中獲得目的無菌斑馬魚。在本專利技術的一個實施例中，所述目的大小的斑馬魚具體為所述受精卵孵化后1-6天的斑馬魚。所述GZM溶液的溶劑為水，溶質為海鹽；所述海鹽在所述GZM溶液的含量為每升所述GZM溶液中含有60mg所述海鹽。所述AB-GZM溶液的溶劑為水，溶質及其濃度如下:250ng/mL的兩性霉素Β、5 μ g/mL的卡那霉素、100 μ g/mL的氨節霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59 μ g/mL的所述海鹽。在上述方法中，步驟(1)中，所述培養的溫度具體為28.5°C ;所述培養的時間具體為 4.5h。在上述方法中，步驟(3)中，所述浸泡的時間具體為lmin。在上述方法中，步驟(5)中，所述漂白的時間具體為15min。在上述方法中，步驟(6)中，所述培養的溫度具體為28.5°C ;所述培本文檔來自技高網...

【技術保護點】
無菌斑馬魚的生產方法，包括如下步驟：（1）將離體的斑馬魚受精卵置于AB?GZM溶液中，于25?29℃培養3?8h；（2）將步驟（1）處理后的所述受精卵用所述AB?GZM溶液進行漂洗；（3）將步驟（2）漂洗后的所述受精卵置于濃度為0.005g/L的聚維酮碘水溶液中，浸泡1?2min；（4）將步驟（3）浸泡后的所述受精卵用無菌GZM溶液進行漂洗；（5）將步驟（4）漂洗后的所述受精卵用漂白劑漂白10?20min；（6）將步驟（5）漂白后的所述受精卵用所述無菌GZM溶液進行漂洗，漂洗后將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養，培養溫度為25?29℃，光周期為L10：D14至L14：D10，直至所述受精卵孵化得到幼體魚；（7）對所述幼體魚每天進行所述無菌GZM溶液的半量換液培養，直至所述幼體魚長成為目的大小的斑馬魚，從所述目的大小的斑馬魚中獲得目的無菌斑馬魚；所述GZM溶液的溶劑為水，溶質為海鹽；所述海鹽在所述GZM溶液的含量為每升所述GZM溶液中含有60mg所述海鹽；所述AB?GZM溶液的溶劑為水，溶質及其濃度如下：250ng/mL的兩性霉素B、5μg/mL的卡那霉素、100μg/mL的氨芐霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59μg/mL的海鹽。...

【技術特征摘要】
1.無菌斑馬魚的生產方法，包括如下步驟: (1)將離體的斑馬魚受精卵置于AB-GZM溶液中，于25-29°C培養3_8h； (2)將步驟(I)處理后的所述受精卵用所述AB-GZM溶液進行漂洗； (3)將步驟(2)漂洗后的所述受精卵置于濃度為0.005g/L的聚維酮碘水溶液中，浸泡l_2min ； (4)將步驟(3)浸泡后的所述受精卵用無菌GZM溶液進行漂洗； (5)將步驟(4)漂洗后的所述受精卵用漂白劑漂白10-20min； (6)將步驟(5)漂白后的所述受精卵用所述無菌GZM溶液進行漂洗，漂洗后將所述受精卵置于所述無菌GZM溶液中培養，培養溫度為25-29°C，光周期為LlO:D14至L14:D10，直至所述受精卵孵化得到幼體魚； (7)對所述幼體魚每天進行所述無菌GZM溶液的半量換液培養，直至所述幼體魚長成為目的大小的斑馬魚，從所述目的大小的斑馬魚中獲得目的無菌斑馬魚； 所述GZM溶液的溶劑為水，溶質為海鹽；所述海鹽在所述GZM溶液的含量為每升所述GZM溶液中含有60mg所述海鹽； 所述AB-GZM溶液的溶劑為水，溶質及其濃度如下:250ng/mL的兩性霉素Β、5 μ g/mL的卡那霉素、100 μ g/mL的氨節霉素、10U/ml的青霉素、10U/ml的鏈霉素、59 μ g/mL的海鹽。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述培養的溫度為28.5°C ；或 所述培養的時間為4.5h。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周志剛，覃初斌，徐俐，楊雅麟，何夙旭，張美超，李青，余強，
申請(專利權)人：中國農業科學院飼料研究所，
類型：發明
國別省市：