本發明專利技術提供了一種冬蟲夏草發酵菌絲體活性組分的發酵及提取方法。該方法根據仿生學原理，模擬人體胃腸道酸堿環境，在近人體溫度下，加以攪拌裝置，模擬胃腸道蠕動方式，從而盡可能多地提取原藥中的有效組分，使其更接近藥物在體內達到平衡后的有效成分群。該方法反應溫和，不僅大大節約了能量，而且避免了有機溶劑對環境的污染以及易燃、易爆和對生產環境的特殊要求，易于工業上生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
冬蟲夏草菌是鱗翅目蝙fe蛾科fe蛾屬幼蟲被中國被毛孢(Hirsutellasinensis)寄生后形成的蟲菌復合體，是我國青藏高原的特色資源，屬國家二級保護的名貴藥材。由于天然冬蟲夏草具有嚴格的寄生性和特殊的地理生長環境，因而產量有限，力口上近年采挖過度，使也是冬蟲夏草資源銳減，根本無法滿足保健和用藥的需求。所以采用現代生物發酵技術深層發酵培養冬蟲夏草菌絲體是克服利用野生資源生物量受限的最佳途徑和實現有用代謝產物開發利用的基礎。冬蟲夏草無性型發酵的菌絲體有與天然冬蟲夏草具有相同或相似的化學成分和藥理作用，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血壓等功效。冬蟲夏草發酵菌絲體組成復雜，含有蟲草素、蟲草腺苷、D-甘露醇、蟲草多糖等多種生物活性成分，生物利用價值高。目前報道的提取冬蟲夏草菌絲體中活性成分的方法諸如熱水浸提法、水提醇沉法、醇提法等，存在著提取方法和過程單一、提取溫度高、有效成分活性破壞大、無法充分提取利用好冬蟲夏草菌絲體中的有效成分。申請號為201210000824.X的中國專利技術專利申請中公開了一種蛹蟲草腺苷的提取方法，該工藝以蛹蟲草子實體經低溫超微粉碎后先`進行反復凍融3 7次，再模擬人體胃腸道酸堿環境，應用半仿生提取工藝對蛹蟲草中的腺苷進行3次連續微波加熱提取，最后用高效液相色譜儀測定提取液中腺苷的含量。該半仿生提取法存在僅以其中的蟲草腺苷含量為指標，同時仍然采用了微波加熱提取方式，存在易破壞蟲草中的活性成分的缺點。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種冬蟲夏草發酵菌絲體活性組分的氣升發酵培養及仿生提取方法。本專利技術采用的技術方案是:，所述方法包括:(I)種子液制備:液體種子培養基經滅菌后接入中國被毛孢菌株，5(T300rpm、1(T3(TC下振蕩培養2 35天，得到種子液；所述液體種子培養基組成如下:碳源0.5 4%，氮源0.1 2%,KH2PO40.01 0.5%,MgSO40.01 0.5%，溶劑為水，ρΗ6.0 7.0 ;所述碳源為下列之一或其中兩種以上的混合物:葡萄糖、蔗糖、玉米粉、玉米淀粉；所述氮源為下列之一或其中兩種以上的混合物:蛋白胨、酵母粉、蠶蛹粉、麥麩、豆餅粉；上述培養基中濃度為質量體積百分比(w/v),某組分濃度1%表示IOOmL培養基中含有該組分Ig ；(2)發酵培養:液體發酵培養基以2 25%體積比接種量接入種子液,在氣升式發酵罐中進行發酵，罐壓0.02、.07Mpa，發酵罐通氣量為1:0.2V/V.mirTl: 3V/V.min (即每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比)，培養溫度15 25°C，培養時間3 40天；所述液體發酵培養基組成同液體種子培養基；當發酵菌球經顯微鏡鏡檢發現大量菌絲，殘糖降至1.0%以下，視為發酵終點，放罐；(3)菌絲體超微粉碎處理:發酵液離心后，所得菌絲體進行真空冷凍干燥，再放入超微粉碎機中于5 30°C下進行低溫粉碎2 20min，得到菌絲體超微粉；(4)發酵菌絲體仿生提取:菌絲體超微粉加入至1(Γ50倍質量的水中，加入足量酶1，調pH值為1.0 3.0，35 371:、40 300印111下攪拌提取20mirTl50min，離心，得上清液1，取沉淀加入至10 50倍質量的水，加入足量酶2，調pH值為8.0 10.0，35 37°C、5(T250rpm下攪拌提取10mirTl20min，離心，得上清液2 ;合并上清液I和上清液2，調pH值為中性，即得冬蟲夏草發酵菌絲體活性組分；經檢測，該組分中含有蟲草素、蟲草腺苷、甘露醇、多糖、SOD等活性成分；所述酶I為下酶中的一種或多種:①胃蛋白酶、②木瓜蛋白酶、③α-淀粉酶、④凝乳酶；所述酶2為下列中的一種或多種:①腸肽酶、②胰蛋白酶、③凝乳酶、④堿性蛋白酶。所用酶均采用市購商品酶，通常的，胃蛋白酶酶活為10000U/g 200000U/g，凝乳酶酶活為3000U/g 30000U/g，胰蛋白酶酶活為20000U/g 1000000U/g，木瓜蛋白酶酶活為50000U/g 800000U/g，堿性蛋白酶酶活為 20000U/g 400000U/g，腸肽酶 500U/g 2000U/g，α -淀粉酶酶活為50000U/g 1000 000U/g。優選的，所述酶I為胃蛋白酶，或者為胃蛋白酶與木瓜蛋白酶、α-淀粉酶或凝乳酶的混合物，胃蛋白酶用量為200(Tl0000U/g菌絲體超微粉，木瓜蛋白酶用量為100(T5000U/g菌絲體超微粉，α -淀粉酶用量為100(T3000U/g菌絲體超微粉，凝乳酶用量為5(T200U/g菌絲體超微粉。優選的，所述酶2為腸肽酶與胰蛋白酶、凝乳酶、堿性蛋白酶中一種或多種的混合物；腸肽酶用量為廣20U/g菌絲體超微粉，胰蛋白酶用量為10(T500U/g菌絲體超微粉，凝乳酶用量為20(T500U/g菌絲體超微粉，堿性蛋白酶用量為30(T800U/g菌絲體超微粉。更為優選的，所述酶I為胃蛋白酶與凝乳酶的混合物，胃蛋白酶用量為500(T6000U/g菌絲體超微粉，凝乳酶用量為8(Tl00U/g菌絲體超微粉；所述酶2為腸肽酶與胰蛋白酶的混合物，腸肽酶用量為5 10U/g菌絲體超微粉，胰蛋白酶用量為30(T500U/g菌絲體超微粉。本專利技術方法是根據仿生學原理，模擬人體胃腸道酸堿環境，在近人體溫度下，加以攪拌裝置，模擬胃腸道蠕動方式，從而盡可能多地提取原藥中的有效組分，使其更接近藥物在體內達到平衡后的有效成分群。該工藝打破了以往只提取單一有效成分的西醫西藥模式，體現了中醫藥多種成分復合作用的特點，避免了傳統的水煎工藝和水煎醇沉提取工藝僅適合提取單一成分，易造成活性組分破壞和損失的弊端。同時又克服了半仿生提取法的高溫煎煮易破壞有效成分的缺點。由于反應溫和，不僅大大節約了能量，而且避免了有機溶劑對環境的污染以及易燃、易爆和對生產環境的特殊要求，易于工業上生產。與現有技術相比，本專利技術具有如下優點:1、本專利技術采用氣升式發酵罐液體培養中國被毛孢菌株，具有氣液混合均勻、對菌絲體剪切力小等優點，避免了通用型攪拌槳式發酵罐由于其強烈的機械攪拌產生剪切作用力，對中國被毛孢菌絲生長及其次生代謝產物的影響。2、本專利技術對冬蟲夏草菌絲體采用低溫超微粉碎，在保護菌絲體中活性組分的同時，使其有效組分更易在提取中溶出和釋放。3、本專利技術采用仿生提取方法，在近人體溫度下，模擬人體胃腸道酸堿環境和胃腸道蠕動方式，使所得提取物更接近藥材在體內達到平衡后的有效成分群。避免了傳統的水煎工藝和有機溶劑提取工藝易造成活性成分破壞及對環境的污染。與常規提取工藝相比，采用仿生提取，冬蟲夏草菌絲體中有效成分的提取得率和活性得以提高。4、本專利技術方法還適用其他藥用真菌發酵菌絲體及相關中藥材中活性組分的提取。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術進行進一步描述，但本專利技術的保護范圍并不僅限于此:本專利技術使用的菌株:是從天然冬蟲夏草子座分離出的中國被毛孢菌株(Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yu&Zeng),且已用分子生物學方法確認為冬蟲夏草的無性型，由中國科學院微生物研究所提供。斜面菌種的制備與處理:斜面菌種培養基采用加富PDA培養基，接種后于1(T30°C下培養1(Γ60天。實施例本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種冬蟲夏草發酵菌絲體活性組分的發酵及提取方法，所述方法包括：（1）種子液制備：液體種子培養基經滅菌后接入中國被毛孢菌株，50~300rpm、10~30℃下振蕩培養2~35天，得到種子液；所述液體種子培養基組成如下：碳源0.5～4%，氮源0.1～2%，KH2PO40.01~0.5%，MgSO40.01~0.5％，溶劑為水，pH6.0~7.0；所述碳源為下列之一或其中兩種以上的混合物：葡萄糖、蔗糖、玉米粉；所述氮源為下列之一或其中兩種以上的混合物：蛋白胨、酵母粉、蠶蛹粉、麥麩、豆餅粉；（2）發酵培養：液體發酵培養基以2～25%體積比接種量接入種子液，在氣升式發酵罐中進行發酵，罐壓0.02~0.07Mpa，發酵罐通氣量為1:0.2V/V.min~1:3V/V.min，培養溫度15～25℃，培養時間3~30天；所述液體發酵培養基組成同液體種子培養基；（3）菌絲體超微粉碎處理：發酵液離心后，所得菌絲體進行真空冷凍干燥，再放入超微粉碎機中于5~30℃下進行低溫粉碎2~20min，得到菌絲體超微粉；（4）發酵菌絲體仿生提取：菌絲體超微粉加入至10~50倍質量的水中，加入足量酶1，調pH值為1.0~3.0，35~37℃、40~300rpmrpm下攪拌提取20min~150min，離心，得上清液1，取沉淀加入至10~50倍質量的水，加入足量酶2，調pH值為8.0~10.0，35~37℃、50~250rpmrpm下攪拌提取10min~120min，離心，得上清液2；合并上清液1和上清液2，調pH值為中性，即得冬蟲夏草發酵菌絲體活性組分；所述酶1為下酶中的一種或多種：①胃蛋白酶、②木瓜蛋白酶、③α?淀粉酶、④凝乳酶；所述酶2為下列中的一種或多種：①腸肽酶、②胰蛋白酶、③凝乳酶、④堿性蛋白酶。...
【技術特征摘要】
1.一種冬蟲夏草發酵菌絲體活性組分的發酵及提取方法，所述方法包括: (1)種子液制備:液體種子培養基經滅菌后接入中國被毛孢菌株，5(T300rpm、l(T3(rC下振蕩培養2 35天，得到種子液；所述液體種子培養基組成如下:碳源0.5 4%，氮源0.1 2%，KH2PO40.01 0.5%，MgSO40.01 0.5%，溶劑為水，ρΗ6.0 7.0 ;所述碳源為下列之一或其中兩種以上的混合物:葡萄糖、蔗糖、玉米粉；所述氮源為下列之一或其中兩種以上的混合物:蛋白胨、酵母粉、蠶蛹粉、麥麩、豆餅粉； (2)發酵培養:液體發酵培養基以2 25%體積比接種量接入種子液,在氣升式發酵罐中進行發酵，罐壓0.02、.07Mpa,發酵罐通氣量為1: 0.2V/V.mirTl: 3V/V.min,培養溫度15 25°C，培養時間3 30天；所述液體發酵培養基組成同液體種子培養基； (3)菌絲體超微粉碎處理:發酵液離心后，所得菌絲體進行真空冷凍干燥，再放入超微粉碎機中于5 30°C下進行低溫粉碎2 20min，得到菌絲體超微粉； (4)發酵菌絲體仿生提取: 菌絲體超微粉加入至1(Γ50倍質量的水中，加入足量酶1，調pH值為1.0 3.0, 35 37°C、40 300rpmrpm下攪拌提取20min 150min,離心,得上清液I,取沉淀加入至10 50倍質量的水，加入足量酶2，調pH值為8.0 10.0, 35 37°C...
【專利技術屬性】
技術研發人員：程俊文，付立忠，賀亮，魏海龍，胡傳久，李海波，
申請(專利權)人：浙江省林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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