測量樣本中激發態壽命的方法技術

本發明專利技術公開了一種測量樣本中激發態壽命的方法，特別是測量熒光壽命的方法，以及執行這種方法的設備。首先，生成激發脈沖并用該激發脈沖照亮樣本區域。隨后，生成表示激發脈沖的功率-時間曲線的第一數字數據序列，并且根據第一數字數據序列確定第一開關時刻。此外，利用檢測器檢測從樣本區域發出的檢測光，生成表示檢測光的功率-時間曲線的第二數字數據序列，并且根據第二數字數據序列確定第二開關時刻。最后，計算第一和第二開關時刻之間的時間差。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，具體地，涉及測量熒光壽命的方法以及用于實施這種方法的設備。本專利技術還涉及測量樣本中激發態壽命的設備，具體地，涉及測量熒光壽命的設備，該設備包括用于產生激發脈沖以利用該激發脈沖照亮樣本區域的光源以及用于檢測從樣本區域發出的檢測光的檢測器。
技術介紹
通過分析利用一種或多種熒光染料標記的樣本的激發態壽命，可獲得與樣本性質有關的重要信息。尤其是當使用多種熒光染料時，可以通過利用熒光壽命成像顯微儀(FLIM)獲得與被分析的樣本區域有關的信息(例如與其成分和環境有關的信息)。在細胞生物學中，例如，可以通過測量熒光染料的壽命間接地推斷出樣本區域中的鈣離子濃度。現有多種方法來測量熒光染料的激發態壽命。一些方法在1999年KluwerAcademic/Plenum 出版的由 Joseph R.Lakowicz 所著的教科書 “Principles ofFluorescence Spectroscopy”第二版中有所描述。例如,可以調制激發光隨著時間的功率，從而可以通過發出光的相位延遲推斷出激發態的壽命。還可以利用短光脈沖激發熒光染料，從而可以電子地測量發射脈沖的時間延遲。舉例來說，德國專利公開文獻DE 102004017956A1描述了一種分析樣本中激發態的壽命的顯微鏡，其包括至少一個用于產生激發光的光源以及至少一個用于接收從樣本發出的檢測光的檢測器。顯微鏡的特征在于:光源包括發出脈沖激發光的半導體激光器以及調整設備，調整設備用于將脈沖重復頻率調整至樣本的特定的壽命特性。具體地，數據分析所需的電子設備是可商購的，其通常以PC插卡的形式提供。然而，除了高成本之外，這樣的時間測量卡具有死區時間特別長的缺點，從而，在樣本激發之后，其僅能夠檢測第一個檢測脈沖(第一個檢測光子)的到達然后在很長的一段時間內處于“盲”狀態。最終，對于用戶來說，包含在從樣本發出的檢測光中的信息的很大一部分仍然是隱藏的。此外，不可能對激發脈沖實現高重復頻率，因此，也不可能在一個測量周期內進行頻繁地測量。實際可實現的測量率遠低于可商購的脈沖激光器的一般重復頻率。出于該原因，舉例來說，需要十分長的時間才能收集足夠的數據以生成FLIM影像。
技術實現思路
因此，本專利技術的一個目的在于提供一種可能在較短的時間內獲得更精確測量結果的方法。該目的是通過包括下述步驟的方法來實現的:a.生成激發脈沖并用該激發脈沖照亮樣本區域，b.生成表示激發脈沖的功率-時間曲線的第一數字數據序列，c.根據第一數字數據序列確定第一開關時刻，d.利用檢測器檢測從樣本區域發出的檢測光，e.生成表示檢測光的功率-時間曲線的第二數字數據序列，f.根據第二數字數據序列確定第二開關時刻，及g.計算第一和第二開關時刻之間的時間差。本專利技術的另一目的是提供一種可能在較短的時間內獲得更精確測量結果的設備。該目的是通過上述類型的設備來實現的，該設備包括控制裝置，該控制裝置:a.生成表示激發脈沖的功率-時間曲線的第一數字數據序列，b.根據第一數字數據序列確定第一開關時刻，c.生成表示檢測光的功率-時間曲線的第二數字數據序列，d.根據第二數字數據序列確定第二開關時刻，e.計算第一和第二開關時刻之間的時間差。根據本專利技術，尤其發現:僅當信息處理控制裝置也能夠檢測這些發生在第一光子到達之后的但仍屬于同一激發脈沖的光子事件時，可以獲得除第一光子的到達時間之外的額外信息。還發現，這可以通過將模擬測量信號立即轉換成數字序列而實現。具體地，本專利技術有利地使得能夠以80MHz及以上的重復頻率(對應于可商購的脈沖激光器的頻率)循環地重復測量。此外，可以獲得更精確的與樣本的壽命特點有關的信息(具體的由于高數據處理速度)，不僅在任意一個時刻中檢測了第一光子的到達時間，還檢測了所有光子事件，只要有足夠的激發功率。在方法的一種具體實施方式中，激發脈沖源自主光脈沖，主光脈沖的一部分被傳送到激發檢測器，激發檢測器生成第一模擬電信號，第一模擬電信號的幅度-時間曲線取決于主光脈沖的該部分的功率的時間曲線，并且，為了生成第一數字數據序列，第一模擬電信號具體地以預定和/或可預定的第一時隙在時間上采樣。具體地，光源可生成主光束，該主光束被光束分離器分成包括激發脈沖的激發束以及測量束，激發檢測器可接收測量束并生成第一模擬電信號，第一模擬電信號的幅度-時間曲線取決于測量束的功率的時間曲線，并且，為了生成第一數字數據序列，控制裝置具體地以預定和/或可預定的第一時隙在時間上對第一模擬電信號進行采樣。舉例來說，可以通過從標準化電信號(具體地，二進制數字)生成第一數據序列而實現第一數據序列的快速生成，生成的方式如下:當取樣的幅度低于定義的和/或可定義的第一激發閾值時，生成較低的標準化信號(例如“0”)，或者當取樣的幅度高于定義的和/或可定義的第二激發閾值時，生成不同于較低標準化信號的較高的標準化信號(例如“ I”)。有利地，檢測器可生成第二模擬電信號，第二模擬電信號的幅度-時間曲線取決于檢測光的功率的時間曲線，并且，為了生成第二數字數據序列，控制裝置具體地以預定和/或可預定的第二時隙在時間上對第二模擬電信號進行采樣。類似于第一數據序列，可以從標準化電信號(具體地，二進制數字)生成第二數據序列，生成的方式如下:當取樣的幅度低于定義的和/或可定義的第一激發閾值時，生成較低的標準化信號，或者當取樣的幅度高于定義的和/或可定義的第二激發閾值時，生成不同于較低標準化信號的較高的標準化信號。為了能夠最大程度上檢測到所有的光子事件，在有利的實施方式中，為了生成數據序列，具體地由控制裝置以遠高于重復頻率的采樣頻率對第一和/或第二模擬電信號進行采樣。具體地，以比重復頻率高大于50倍，具體地高大于100倍的采樣頻率對第一和/或第二模擬電信號進行采樣。在一種特別有利的實施方式中，以比重復頻率高大約125倍的米樣頻率對第一和/或第二模擬電信號進行米樣。在一種具體實施方式中，以IOGHz的采樣頻率對第一和/或第二模擬電信號進行采樣，而重復頻率為80MHz。在一種具體實施方式中，為了進一步增加時間分辨率，重復地對第一模擬電信號進行采樣。具體地，可以重復地對第一模擬電信號進行采樣，但帶有比時隙短的時間偏移量，具體地是連續可調的時間偏移量。在一種提供特別精確結果的特別有利的實施方式中，對第一模擬電信號采樣η次，但帶有對應于時隙的第η個系數的時間偏移量。例如，在雙采樣的情況下，提供的時間偏移量可以相應地是時隙的持續時間的一半。優選地，隨后將多次采樣的采樣結果在數學上相結合，具體地相互交錯，從而分別產生第一數據序列和第二數據序列。具體地，通過多次采樣和數據上的結合，可以產生包含η倍更多數據的數據序列，并且，與通過對單一測量期間的單一采樣相比，具有明顯更高的信息內容。舉例來說，當使用包括比較器和/或恒定系數鑒頻器的第一采樣裝置時，可以更快且更可靠地生成第一數字數據序列。具體地，這使得可能毫無壓力地實現數十Gbits (例如，28Gbits)范圍內的采樣率。這同樣適于于第二數字數據序列的生成，其有利地利用第二采樣裝置進行，該第二采樣裝置也包括比較器和/或恒定系數鑒頻器。采樣率可以相同，但并非必須相同。而且，取決于具體的應用，用于生成第一數字數據序列的的采樣率可以不同于用于生成第二數本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種測量樣本中激發態壽命的方法，特別是測量熒光壽命的方法，包括下述步驟：a.生成激發脈沖并用該激發脈沖照亮樣本區域，b.生成表示激發脈沖的功率?時間曲線的第一數字數據序列，c.根據第一數字數據序列確定第一開關時刻，d.利用檢測器檢測從樣本區域發出的檢測光，e.生成表示檢測光的功率?時間曲線的第二數字數據序列，f.根據第二數字數據序列確定第二開關時刻，及g.計算第一和第二開關時刻之間的時間差。

【技術特征摘要】
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：B·威茲高斯蓋，
申請(專利權)人：徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司，
類型：發明
國別省市：德國;DE