用于照明樣品的方法和系統技術方案

本發明專利技術涉及一種在SPIM顯微術中用于照明樣品的系統，包括：光源，所述光源用于產生光束；光學裝置，所述光學裝置用于從所述光束形成光帶，特別地用于從至少一個方向對照明平面上的樣品進行大體上平面照明；至少一個物鏡，所述至少一個物鏡具有被設計的且意欲將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至檢測器的物鏡光學部件，所述物鏡光學部件與所述光帶相互作用；且進一步包括光轉向器件，所述光轉向器件放置在所述物鏡光學部件下游以將所述光帶偏轉，以使在偏轉之后所述光帶相對于所述物鏡的光軸以非零度的角度、特別是以直角傳播，和/或位于不平行于所述物鏡的光軸的平面上。本發明專利技術還涉及一種在SPIM顯微術中用于照明樣品的方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及在SPM顯微術中用于照明樣品的方法和系統。本專利技術還涉及顯微鏡，特別是掃描顯微鏡和/或共焦掃描顯微鏡，以及涉及使用該系統和實施該方法用于對樣品進行顯微成像的實驗設備。
技術介紹
上文所述的本專利技術所相關的選擇性平面照明顯微術(SPM)技術在例如Lindek等；Journal of modern optics, 1999,卷 46,序號 5,頁 843-858 中有描述。在DE 10257423A1中描述了根據SP頂方法操作的顯微鏡。在該顯微鏡中，當觀測發生在垂直于照明光帶的平面時，樣品被窄光帶照明。此時，通過兩個分開的光學系統實施照明和檢測，其中，兩個分開的光學系統具有分開的光學部件，特別地，具有兩個分開的被定向為相互垂直的物鏡。光帶通過照明物鏡和上游的圓柱狀的光學元件產生。對于圖像獲取，樣品被移動通過相對于檢測器靜止的光帶以使用平面檢測器分層地捕獲熒光和/或散射光。所獲得的斷層圖像數據可以匯集在ー個表示樣品的三維圖像的數據集中。為了產生盡可能窄的光帶，照明物鏡必須具有相應的大數值孔徑。另外，照明物鏡的自由工作距離必須足夠大以防止與觀測物鏡的碰撞。在對某些樣品(尤其是生物樣品)進行成像時，兩個物鏡的垂直布置可能是不利的。例如，將球狀物體以無碰撞模式放置在物鏡的直角布置之下通常是不可能的。除了對于樣品制備的嚴格要求之外，在樣品中還頻繁地發生不期望的成明。在WO 2010/012980A1所描述的改進的SP頂技術中，使用同一個物鏡進行照明和檢測。該物鏡的入射光瞳在偏心的位置被欠照明，即，照明光束通過橫向地偏離光軸的入射光瞳的一部分。物鏡上游的圓柱狀透鏡在樣品中產生光條，該光條向物鏡的光軸傾斜。然后，被該光條所照明的樣品區域通過物鏡被成像在檢測器上。但是，該器件被設計為專門用于通過光條對樣品的傾斜照明而不允許用于不同的用途，且尤其不允許用于樣品的逐點共焦掃描或光條的空間光強度分布的變化，特別地，不允許用于通過被定向為垂直于物鏡的光軸的光條的照明。德國專利公布DE 10 2004 034 957A1描述ー種用于通過顯微鏡物鏡進行顯微觀測的布置，其中，用于照明樣品的光的光導設置在透鏡光學部件外部的物鏡外殼中。照明光最初在光導內平行于物鏡光軸傳播，然后撞擊在小孔徑的反射器上，反射器安裝在物鏡外売上，且反射器在另外的成像元件的幫助下，將照明光沿著垂直于顯微鏡物鏡的光軸的方向聚焦在樣品上，從而垂直于觀測方向。在此，根據SPIM原理還設置樣品的平面照明。盡管使用以這種方式配置的顯微鏡物鏡確實消除使用用于照明光的另外的物鏡的需要，具有另外的光導的專門的物鏡和反射器的專門設計在技術上非常復雜且價格昂貴。
技術實現思路
本專利技術的目的在于改進上文所述的在SPIM顯微術中用于照明樣品的方法和系統，以使平面樣品照明(特別是在垂直于觀測方向的平面樣品照明)成為可能，當優選地允許使用許多總是存在于顯微鏡(特別是掃描顯微鏡)中的部件時，平面樣品照明是快捷可調的，且是可靠的以及多用途的。該目的通過根據權利要求1的用于照明樣品的方法，以及通過根據權利要求17的用于照明樣品的系統實現。本專利技術有利的實施例為從屬權利要求的主題。相應地，本專利技術提供ー種在SPM顯微術中用于照明樣品的方法，包括以下步驟:a.產生光束；b.經過與所述光束相互作用的光學裝置從所述光束形成光?。?c.使所述光帶通過至少一個物鏡，所述物鏡具有被設計的且意欲將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至檢測器的物鏡光學部件，所述物鏡光學部件與所述光帶相互作用；和d.通過所述物鏡光學部件下游的光轉向器件將所述光帶偏轉，以使在偏轉之后所述光帶相對于所述物鏡的光軸以非零度的角度、特別是直角傳播，且優選地被聚焦在所述樣品上以照明所述樣品。進ー步地，本專利技術提供一種系統，包括:a.光源，所述光源用于產生光束；b.光學裝置，所述光學裝置用于從所述光束形成光帶，特別地用于從至少ー個方向對照明平面上的樣品進行大體上平面照明；c.至少ー個物鏡，所述至少一個物鏡具有被設計的且意欲將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至檢測器的物鏡光學部件，所述物鏡光學部件與所述光帶相互作用；和d.光轉向器件，所述光轉向器件放置在所述物鏡光學部件下游以將所述光帶偏轉，以使在偏轉之后所述光帶相對于所述物鏡的光軸以非零度的角度、特別是以直角傳播，和/或位于不平行于所述物鏡的光軸的平面上。根據本專利技術，發現使用不具有在顯微鏡外殼內部的另外的光學部件、照明光經過物鏡光學部件隨后相對于物鏡的光軸以非零度的角度、特別是以直角通過光轉向器件可聚焦至樣品上的本質上常規的顯微鏡物鏡，可以實現根據SP頂方法的樣品照明，特別是在垂直于觀測方向的平面上的平面照明。根據本專利技術，使用顯微術中慣常的和已知的光源(例如CW激光或脈沖激光)產生照明樣品的光束。在本專利技術有利的實施例中，根據該創造性的方法和系統的用于形成光帶的光學裝置可以具有能夠在照明平面上移動光束的光束偏轉器，且優選地，以這種速度移動以使，實際上，在照明平面上存在光帶，和/或設置用于檢測從樣品和下游的顯微鏡的分析器發出的光的檢測器不能夠從連續光帶中辨別出該照明，和/或所獲取的圖像數據與在通過連續光帶照明的情況下得到的數據不同或者基本不同?？梢允褂猛ㄟ^光束偏轉器產生的光束的樞轉運動，特別是，在樣品內移動焦點，從而從特定的方向為樣品的平面照明產生聚焦的光帶。這可以通過，例如，光束偏轉器以足夠的速度將光束在物鏡的上游來回傾斜實現，以使作為結果的聚焦的光帶在一段時間的平均的振動在樣品內的照明平面上帶來盤狀或者平面的光分布。光束偏轉器優選地將光束偏轉以使得在物鏡的入射光瞳的區域中的傾斜點保持近似地靜止，而在光束偏轉器的方向上離入射光瞳一段距離處，光束相對于平行于光軸的參考方向進行樞轉運動。光束的該樞轉運動通過物鏡和下游的光轉向器件被轉化為光束的焦點的相應的運動，通過物鏡產生該焦點(除其他事物之外)。對于顯微術，優選地將樣品放置在該焦點中。焦點的實際大小和焦點在樣品上的運動的幅度取決于物鏡光學部件的具體設計以及可能取決于可以使用在光路中的另外的光學元件。在特別適合的以及技術上易于實施的實施例中，光束偏轉器具有至少ー個旋轉反射鏡和/或傾斜反射鏡(優選地為檢流計反射鏡)，和/或旋轉棱鏡和/或可移動的透鏡和/或聲光偏轉器。光束偏轉器可以為，特別地，為可用的掃描顯微鏡或者共焦掃描顯微鏡的光束偏轉器。在本專利技術的另ー個實施例中，除了光束偏轉器之外或者替代光束偏轉器，，還可以設置圓柱形的光學元件作為用于形成光帶的光學裝置。在本專利技術的另ー個有利的實施例中，光帶的形狀和/或位置和/或定向通過如上所述的光學裝置和/或物鏡和/或光轉向器件被調整或可被調整?？梢酝ㄟ^光束偏轉器調整樞轉運動以調整光帶的位置和/或定向。光帶的形狀，特別是光帶寬帶可以通過，例如，對樞轉運動選擇不同的振動幅度而被調整。在一個特別的實施例中，光束的和/或光帶的和/或檢測光的光學路徑相互匹配，以使光帶具有在待觀測樣品中的位置處的焦點，且從樣品中的該位置發出的檢測光具有在檢測器上的檢測焦點。檢測器優選地位干與檢測平面對應的平面上。檢測平面的位置和定向基本取決于物體的類型、定向和位置，檢測器的位置以及可能存在于檢測器和物鏡之間的另外的光本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種在SPIM顯微術中用于照明至少一個樣品的方法，包括以下步驟：a.產生光束；b.通過與所述光束相互作用的光學裝置從所述光束形成光帶；c.使所述光帶經過至少一個物鏡，所述至少一個物鏡具有被設計的且意欲將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至檢測器的物鏡光學部件，所述物鏡光學部件與所述光帶相互作用；和d.通過所述物鏡光學部件下游的光轉向器件將所述光帶偏轉，以使在偏轉之后所述光帶相對于所述物鏡的光軸以非零度的角度、特別是直角傳播，且優選地被聚焦在所述樣品上以照明所述樣品。

【技術特征摘要】
2011.10.28 DE 102011054914.51.一種在SPM顯微術中用于照明至少ー個樣品的方法，包括以下步驟: a.產生光束； b.通過與所述光束相互作用的光學裝置從所述光束形成光帶； c.使所述光帶經過至少ー個物鏡，所述至少一個物鏡具有被設計的且意欲將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至檢測器的物鏡光學部件，所述物鏡光學部件與所述光帶相互作用；和 d.通過所述物鏡光學部件下游的光轉向器件將所述光帶偏轉，以使在偏轉之后所述光帶相對于所述物鏡的光軸以非零度的角度、特別是直角傳播，且優選地被聚焦在所述樣品上以照明所述樣品。2.根據權利要求1所述的方法，其中， a.用于形成所述光帶的所述光學裝置具有至少ー個光束偏轉器，和/或 b.用于形成所述光帶的所述光學裝置具有至少ー個光束偏轉器，所述至少ー個光束偏轉器為掃描顯微鏡或者共焦掃描顯微鏡的光束偏轉器的形式，和/或 c.光束偏轉器具有至少ー個旋轉反射鏡和/或傾斜反射鏡、優選地為檢流計反射鏡，和/或旋轉棱鏡和/或可移動的透鏡和/或聲光偏轉器。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，用于形成所述光帶的所述光學裝置具有至少一個圓柱形的光學元件。4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中， a.所述光帶的形狀和/或位置和/或定向被調整，和/或 b.所述光帶的形狀和/或位置和/或定向通過用于形成所述光帶的所述光學裝置和/或所述物鏡和/或所述光轉向器件被調整。5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中， a.所述物鏡為浸沒物鏡，和/或 b.所述物鏡為浸沒物鏡，且浸潰在填充有包圍所述樣品的光學介質的樣品腔或者樣品容器中，和/或 c.將待照明樣品放置在填充有包圍所述樣品的光學介質的樣品腔或者樣品容器中，且將所述光轉向器件浸潰在所述光學介質中或者放置在所述介質中。6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中， a.使用所述物鏡用于照明所述樣品和/或用于將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至所述檢測器，和/或 b.使用另外的物鏡和/或聚光器光學部件用于將從所述樣品發出的檢測光直接地或間接地傳送至所述檢測器。7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中， a.所述光轉向器件被固定地緊固至所述物鏡和/或所述另外的物鏡和/或所述聚光器光學部件，和/或 b.所述光轉向器件被保持至所述物鏡和/或所述另外的物鏡和/或所述聚光器光學部件，以使所述光轉向器件在彈性構件特別是彈簧的力下相對于所述物鏡的光軸以除90度之外的角度可移動，和/或 c.所述光轉向器件設置有至少ー個連接裝置，以使所述光轉向器件作為改型部件被固定地緊固和/或固定地可緊固至所述物鏡和/或所述另外的物鏡和/或所述聚光器光學部件。8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，所述光轉向器件的至少ー個部件與所述物鏡的部件或所述另外的物鏡的部件或所述聚光器光學部件的部件一體制造。9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中， a.用于將所述光帶偏轉的所述光轉向器件具有至少ー個至少部分反射的表面，和/或 b.用于將所述光帶偏轉的所述光轉向器件具有至少ー個至少部分反射的表面，所述反射的表面形成為平面鏡的一部分或者至少部分地形成在圓錐體的內側上。10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中， a.通過來自至少兩個方向的所述光帶照明所述樣品，所述光帶優選地從所述至少兩個方向中的每個被聚焦在所述樣品中的單個焦點區，和/或 b.通過來自平面的所有方向的所述光帶放射狀地照明所述樣品，所述光帶優選地從所述平面的每個方向被聚焦在所述樣品中的單個焦點區，和/或 c.通過改變入射方向，特別地通過所述光轉向器件和/或用于形成所述光帶的所述光學裝置，從至少兩個方向照明所述樣品，和/或 d.通過旋轉入射方向，特別地通過所述光轉向器件和/或用于形成所述光帶的所述光學裝置，通過來自平面的所有方向的所述光帶放射狀地照明所述樣品。11.根據權利要求1至10中任一項所述的方法，其中，用于所述SP頂顯微術，特別地用于在SPM顯微術過程中對所述 樣品的不同層進行成像，所述樣品 a.相對于所述物鏡和所述光轉向器件移動和/或旋轉，和/或 b.放置在光學介質中，特別地在浸沒介質中，和/或 c.放置在樣品腔中，和/或 d.放置在毛細管中，和/或 e.放置在基座上，和/或 f.放置在填充有包圍所述樣品的光學介質的樣品腔中。12.根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中，所述光束和/或所述光帶和/或所述檢測光的光學路徑相互匹配，以使所述光帶具有在待觀測樣品中的位置處的焦點，且從所述樣品中的所述位置發出的所述檢測光具有在所述檢測器上的檢測焦點。13.根據權利要求1至12中任一項所述的方法，其中，特別地為了補償所述光束的光程和所述檢測光的光程之間的光程長度的差異， a.所述光束作為發散光束被引導至所述物鏡，和/或 b.所述光束被僅作用在所述光束上而不作用在所述檢測光上的另外的光學部件所影響，和/或 c.所述檢測光束路徑被加長。14.根據權利要求1至13中任一項所述的方法，其中， a.將所述物鏡和/或所述光轉向器件浸潰在所述樣品腔和/或所述光學介質中，和/或 b.將所述物鏡和/或所述光轉向器件放置在所述樣品腔和/或所述光學介質中。15.根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其中，a.所述光帶與至少ー個激發光束和/或激發光帶疊加以根據受激發射耗盡顯微術的原理提高光學分辨率，以使為了產生圖像的待檢測光所來自的樣品區域比被所述光帶照明的樣品區域??；和/或 b.所述光帶與至少ー個激發光帶疊加以根據受激發射耗盡顯微術的原理提高光學分辨率，所述光帶與所述激發光帶部分地相互重疊且相互平行地定向。16.一種顯微術方法,其中， a.依照根據權利要求1至15中任一項所述的方法照明樣品，和/或 b...

【專利技術屬性】
技術研發人員：維爾納·克尼貝爾，弗蘭克·西克曼，
申請(專利權)人：萊卡微系統CMS有限責任公司，
類型：發明
國別省市：