診斷癌癥的試劑及試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及診斷癌癥的試劑及試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)首次揭示5-羥甲基胞嘧啶(hmc)在組織中的存在情況與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，組織中hmc水平明顯下降提示癌癥的發(fā)生或發(fā)展；并且hmc水平的高低還能指示癌癥的嚴(yán)重程度。因此，檢測(cè)hmc的試劑可良好地應(yīng)用于癌癥的診斷、預(yù)后或分型，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本專利技術(shù)涉及診斷癌癥的試劑及試劑盒。
技術(shù)介紹
DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C) 5位上的碳被甲基化修飾成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG 二核苷酸是發(fā)生DNA甲基化主要的位點(diǎn)，它在基因組中呈不均勻分布。在一些區(qū)域，主要是基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，CpG高于正常概率，這些區(qū)段因此而被稱為CpG島。整個(gè)基因組范圍內(nèi)，約有60%以上基因的啟動(dòng)子區(qū)含有CpG島。總體來說，在哺乳動(dòng)物中5mC約占C總量的2-7%，因此而有了“第五種堿基”之稱。DNA甲基化在正常和異常的生理活動(dòng)中起著重要的作用。它可以抑制基因的表達(dá)，參與對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)維持，調(diào)節(jié)X染色體失活、基因印記、和轉(zhuǎn)座子沉默等重要細(xì)胞功能。TET1,全名 Ten-Eleven Translocation I。Tetl 是一個(gè) 2-0G,Fe++依賴性的 5mC加氧酶，可以將5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?-輕甲基胞卩密唳(5-HydroxymethyICytosine) (hmc)。同時(shí),在大腦細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了 hmc的存在。TETl的生物學(xué)功能仍不知道，由于Tetl是從急性骨髓狀白血病患者的十號(hào)衍生染色體中克隆出來的，而且易位至十一號(hào)染色體上，估計(jì)它與癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但Tetl在癌癥中的作用仍不知道。hmc是1952年在噬菌體中發(fā)現(xiàn)的。1972年發(fā)現(xiàn)hmc也存在于哺乳動(dòng)物中，它存在于小鼠和青蛙的腦DNA中，也存在于大鼠的腦和肝臟中，在腦中hmc大約占總胞嘧啶的20%，在肝臟組織里占總胞嘧啶的6% (40)。目前現(xiàn)有技術(shù)中，還沒有發(fā)現(xiàn)hmc與癌癥的相關(guān)性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供診斷癌癥的試劑及試劑盒。在本專利技術(shù)的第一方面，提供一種5-羥甲基胞嘧啶用作檢測(cè)癌癥的標(biāo)志物的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的癌癥包括(但不限于):腦癌(如膠質(zhì)瘤)、鱗狀上皮癌(如食管癌、皮膚癌、頭頸癌等)、乳腺癌、胃癌、腸癌(如結(jié)腸癌、直腸癌)、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宮癌、胰腺癌、胸腺癌、精原細(xì)胞癌、肌肉瘤。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種5-羥甲基胞嘧啶(hmc)的用途，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)癌癥包括:確定癌癥的嚴(yán)重程度或進(jìn)行癌癥的分型。在另一優(yōu)選例中，所述的5-羥甲基胞嘧啶與載體蛋白連接，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血藍(lán)蛋白(KLH)。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種抗原，所述抗原包含載體蛋白(優(yōu)選沒有免疫原性的)，以及連接于載體蛋白上的一個(gè)或多個(gè)(如1-100個(gè)；更特別地如5、10、12、13、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 個(gè))5_ 羥甲基胞嘧啶。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(0VA)、血藍(lán)蛋白(KLH)。在本專利技術(shù)的另一方面，提供所述的抗原的用途，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種特異性識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶(hmc)的試劑的用途，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶的抗體(包括多克隆抗體或單克隆抗體)。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種多克隆抗體，其特異性地識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶。在另一優(yōu)選例中，所述的多克隆抗體的制備方法為:用所述的抗原免疫兔子，獲取免疫血清，純化后獲得所述的多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的多克隆抗體的制備方法為:將所述的抗原與弗氏佐劑混合(較佳地1:1混合)后，注射到家兔，免疫量0.5±0.2mg，每隔1.5-3周(較佳地2周)免疫I次，免疫2-4次(較佳地3次)，從兔血清中分離多克隆抗體。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種單克隆抗體，其特異性識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶，其由保藏號(hào)為CCTCC No:C201191的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種雜交瘤細(xì)胞株，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為 CCTCC No:C201191o在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種用于檢測(cè)癌癥的試劑盒，其中包括特異性識(shí)別5-羥甲基胞嘧啶的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有:顯色劑等免疫組化試劑。本專利技術(shù)的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖1、MALD1-T0F 4800質(zhì)譜檢測(cè)未偶聯(lián)對(duì)照組BSA (下圖)和偶聯(lián)后產(chǎn)物hmc-BSA(上圖)的分子量。圖2、SDS-PAGE分離偶聯(lián)后產(chǎn)物(conju)、未偶聯(lián)對(duì)照組BSA(Control，Ctrl)和未經(jīng)過反應(yīng)的BSA對(duì)照。圖3、MALD1-T0F 4800質(zhì)譜檢測(cè)未偶聯(lián)對(duì)照組OVA (control)和偶聯(lián)后各種產(chǎn)物的分子量。U-OVA、5mU-0VA、A-OVA, G-OVA, hmc-OVA分別是尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、和5-羥甲基胞嘧啶偶聯(lián)到OVA上。圖4、紫外分光光度分析游離的KLH、hmc、KLH和hmc偶聯(lián)反應(yīng)后產(chǎn)物的吸收峰，以判斷偶聯(lián)反應(yīng)是否成功。圖5、免疫印跡檢測(cè)hmc兔多克隆抗體HMC-PA01的特異性。5mC或hmc (初始量分別為125納克)以2倍遞減量固定到膜上，與hmc兔多克隆抗體HMC-PA01 (上圖)或5mC抗體(33 D3, Calbiochem, San Diego, CA)(中圖)反應(yīng)后，經(jīng)過二抗和顯色后顯不:hmc的兔多克隆抗體HMC-PAOl只識(shí)別hmc，基本不識(shí)別5-甲基胞嘧啶(5mC)(上圖)。而5mC抗體只認(rèn)識(shí)5mC,不識(shí)別hmc (中圖)。Ponceau-S顯示各點(diǎn)含有稀釋物質(zhì)(下圖)。圖6、免疫熒光染色檢測(cè)hmc兔多克隆抗體HMC-PAOl的特異性。編碼Tetl和GFP的質(zhì)粒(mTETl-1res-GFP)被轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，用DAPI染每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核(左上圖)、hmc兔多克隆抗體HMC-PAOl染hmc (右上圖)、5mC抗體染5mC(左下圖)、綠色顯示mTETl-1res-GFP轉(zhuǎn)入的細(xì)胞(中下圖)，Merge是四個(gè)圖像重疊。圖7、hmc兔多克隆抗體可以被用于免疫共沉淀。小鼠46C ES細(xì)胞(左圖)、293T(control)(中圖)、或轉(zhuǎn)入Tetl的293T細(xì)胞(Tetl)分別用5mC抗體(5mC)或hmc抗體(hmc)進(jìn)行免疫共沉淀,沉淀的DNA經(jīng)Agarose膠分離后,用溴化乙錠染色。Input是用于沉淀的十分之一的DNA用量，IgG是抗體對(duì)照。圖8、免疫印跡檢測(cè)hmc鼠單克隆抗體MA7的特異性。5mC或hmc (初始濃度分別為5納克)以10倍遞減量固定到膜上，與hmc鼠單克隆抗體MA7(上圖)、同時(shí)含有5mC抗體(33 D3, Calbiochem, San Diego, CA)和hmc鼠單克隆抗體MA7 (中圖)反應(yīng)后，經(jīng)過二抗和顯色后顯示:hmc的鼠單克隆抗體只識(shí)別hmc，不識(shí)別5mC (上圖)。而5mC抗體認(rèn)識(shí)5mC (中圖)。Ponceau-S顯示各點(diǎn)含有稀釋物質(zhì)(下圖)。圖9、免疫熒光染色檢測(cè)hmc鼠單克隆抗體MA7的特異性。編碼Tetl和GFP的質(zhì)粒(Tetl-1res-GFP)被轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，用DAPI染每個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核(左上圖)、hmc鼠單克本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種5?羥甲基胞嘧啶用作檢測(cè)癌癥的標(biāo)志物的用途。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種5-羥甲基胞嘧啶用作檢測(cè)癌癥的標(biāo)志物的用途。2.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌癥包括:腦癌、鱗狀上皮癌、乳腺癌、胃癌、腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、子宮癌、胰腺癌、胸腺癌、精原細(xì)胞癌、肌肉瘤。3.一種5-羥甲基胞嘧啶的用途，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑。4.按權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的檢測(cè)癌癥包括:確定癌癥的嚴(yán)重程度或進(jìn)行癌癥的分型。5.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的5-羥甲基胞嘧啶與載體蛋白連接，用于制備檢測(cè)癌癥的試劑。6.按權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的載體蛋白選自:牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血監(jiān)蛋白。7.一種抗原，其特征在于，所述抗原包含載體蛋白，以及連接于載體蛋白上的一個(gè)或多個(gè)5-羥甲基胞嘧啶。8.按權(quán)利要求7所述地抗原，其特征在于，所述的載...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳德桂，張豐，劉一帆，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：