本發明專利技術公開了一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法。以0.05mol/LHCl為溶劑，在室溫下經渦流15~20s并超聲波處理20~30min的步驟抽提2次，從家蠶幼蟲體中有效提取出DNJ。用5mmol/L9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl）在20℃下標記DNJ20~25min，形成具有熒光性的DNJ-FMOC絡合物，用配有熒光檢測器的反相高效液相色譜檢測，根據峰面積計算出DNJ含量。本發明專利技術建立的家蠶幼蟲體DNJ含量測定方法，精密度、重現性與加樣回收率高，穩定地好，可用于大數量家蠶幼蟲制品中DNJ含量的檢測，對于推進家蠶幼蟲體的藥用開發具有積極的社會效益和經濟效益。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
糖尿病是一種內分泌代謝紊亂的常見多發慢性病，臨床癥狀主表現為高血糖。隨著社會經濟條件的改善和飲食結構的改變，近年來糖尿病的患病率大幅度增長，已成為當今醫學上一個嚴重的公共衛生問題，給國民經濟發展造成了很大的影響。目前臨床上用于治療糖尿病的藥劑主要有胰島素類、磺酰脲類、雙胍類及α -糖苷酶抑制劑類這幾類，胰島素類、磺酰脲類、雙胍類藥物會引起肝損傷、血糖過低、水腫等，副作用較大，α -糖苷酶抑制劑為當前開發的重點領域。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)是一種α-糖苷酶抑制劑，可竟爭性地與α-糖苷酶結合，以阻害α-糖苷酶對二糖的水解，使二糖不能被水解成單糖進入血液內，而被直接送入大腸排泄，從而起到了有效降血糖的作用，是當前糖尿病治療藥物開發的一個嶄新領域。國外學 者對DNJ進行了大量的研究，人工化學合成出了許多衍生物，其中N-羥乙基-1-DNJ被開發成了治療糖尿病的新藥一格列米醇(也叫格列本醇)，于1998年用于臨床。但DNJ分子中具有多個(4個)手性中心，與其相關的立體異構體多達15種以上，人工化學合成的其衍生物在藥理藥效與毒副作用上與天然DNJ存在較大的差異，不能滿足當今社會的高水平需求。家蠶是當今地球上室內飼養量最大的經濟資源昆蟲，不僅資源豐富，而且活性物質與營養成分充足，很適宜作為高效、安全生物反應器用于開發生產附價值高、發展前景廣闊的活性藥物。家蠶幼蟲體具有高效合成與富集DNJ的特性，不僅DNJ含量高，而且降血糖效果顯著，可用于糖尿病治療藥物和保健食品的開發。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，是用9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC-Cl)標記DNJ，在配有熒光檢測器的反相高效液相色譜檢測，建立精確、穩定的家蠶幼蟲體DNJ含量檢測方法。為了達到上述目的，本專利技術采用的技術方案如下: 1)家蠶幼蟲于-50°c下真空干燥36h，于-15°c下超微粉碎10 15 min，過80 100目篩，得到家蠶幼蟲粉； 2)取家蠶幼蟲體粉，按重量體積比為1:70(Γ800比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流15 20 s并超聲波處理20 30 min后，用21690 g離心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液； 3)取10UL供試液，與10 μ L 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸鉀緩沖液混和，加入20 μ L5 mmol/L FM0C-C1液，混勻并在20°C水浴鍋中反應20 25 min，加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl來終止反應； 4)反應液用950μ L質量百分比為0.1%醋酸液稀釋，生成的DNJ-FMOC，并用孔徑0.2μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液； 5)將10μ L測定液用進樣器注入色譜柱為DIAMONSIC C18柱的Waters 600高效液相色譜儀，以體積比為1:1的乙腈-0.1%醋酸為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫； 6)用激發光254nm、發射光322 nm的Waters 474熒光檢測器檢測洗脫曲線，根據DNJ-FMOC色譜峰面積按回歸方程Y=0.0002X+ 2.9815計算出1-脫氧野尻霉素含量。本專利技術具有的有益效果是: 本專利技術建立的家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量測定方法，精密度、重現性與加樣回收率高，穩定地好，可用于大數量家蠶幼蟲制品中DNJ含量的檢測，這對于推進家蠶幼蟲體的藥用開發，具有積極的社會效益和經濟效益。具體實施例方式實施例1: 取家蠶幼蟲體粉，按1:700 (ff:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流15 s并超聲波處理30 min后,用21690 g離心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液。取10 μ L供試液，與10 UL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FMOC-Cl液，迅速混勻并在20°C水浴鍋中反應20 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FM0C-C1來終止反應。反應液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀釋，以穩定生成的DNJ-FM0C，并用孔徑0.2 μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液。將10 UL測定液用進樣器注入色譜柱為DIAMONSIC C18柱(250 X 4.60 mm, ID)的Waters 600高效液相色譜儀，以乙腈-0.1%醋酸(1:1，V/V)為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫。用Waters 474熒光檢測器(激發光254 nm，發射光322 nm)檢測洗脫曲線，DNJ與FMOC-CI絡合成的DNJ-FMOC得到很好的分離，根據DNJ-FMOC色譜峰面積按標樣的回歸方程計算出DNJ含量為0.523%，精密度試驗的RSD = 0.6%，穩定性試驗的RSD =1.59%，重現性試驗的RSD = 6.78%，平均加樣回收率為104.5% (RSD=4.64%)。試驗6批次均得到相同的結果。實施例2: 取家蠶幼蟲體粉，按1:800 (W:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流20 s并超聲波處理25 min后,用21690 g離心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液。取10 μ L供試液，與10 UL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FM0C-C1液，迅速混勻并在20°C水浴鍋中反應25 min,加10 μ L 0.lmol/L甘氨酸液，中和剩余的FM0C-C1來終止反應。反應液用950 μ L 0.1%(V/V)醋酸液稀釋，以穩定生成的DNJ-FM0C，并用孔徑0.2 μ m尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液。將10 μ L測定液用進樣器注入色譜柱為DIAMONSIC C18柱(250 X 4.60 mm，ID)的Waters 600高效液相色譜儀，以乙腈-0.1%醋酸(1: 1，V/V)為流動相，按1.0 mL/min流速在常溫下洗脫。用Waters 474熒光檢測器(激發光254 nm，發射光322 nm)檢測洗脫曲線，DNJ與FMOC-CI絡合成的DNJ-FMOC得到很好的分離，根據DNJ-FMOC色譜峰面積按標樣的回歸方程計算出DNJ含量為0.525%，精密度試驗的RSD = 0.56%，穩定性試驗的RSD =1.41%，重現性試驗的RSD = 5.78%，平均加樣回收率為101.2% (RSD=3.12%)。試驗7批次均得到相同的結果。實施例3: 取家蠶幼蟲體粉，按1:750 (ff:V)比例，加入0.05 mol/L HC1，常溫下渦流18 s并超聲波處理20 min后,用21690 g離心20 min,收集上清液,沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液。取10 μ L供試液，與10 UL 0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)混和，加入20 uL 5 mmol/L FMOC-Cl液，迅速混勻并在20°C水浴鍋中反應23 min,加1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種家蠶幼蟲體1?脫氧野尻霉素含量的測定方法，其特征在于：1）家蠶幼蟲于?50℃下真空干燥36?h，于?15℃下超微粉碎10~15?min，過80~100目篩，得到家蠶幼蟲粉；2）取家蠶幼蟲體粉，按重量體積比為1：700~800比例，加入0.05?mol/L?HCl，常溫下渦流15~20?s并超聲波處理20~30?min后，用21690?g離心20?min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液；3）取10?μL供試液，與10?μL?0.4?mol/L、pH8.5的硼酸鉀緩沖液混和，加入20?μL?5?mmol/L?FMOC?Cl液，混勻并在20℃水浴鍋中反應20~25?min，加10?μL?0.1mol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC?Cl來終止反應；4）反應液用950?μL質量百分比為?0.1%醋酸液稀釋，生成的DNJ?FMOC，并用孔徑0.2?μm尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液；5）將10?μL測定液用進樣器注入色譜柱為DIAMONSIC?C18柱的Waters?600高效液相色譜儀，以體積比為1：1的乙腈?0.1%醋酸為流動相，按1.0?mL/min流速在常溫下洗脫；6）用激發光254?nm、發射光322?nm?的Waters?474熒光檢測器檢測洗脫曲線，根據DNJ?FMOC色譜峰面積按回歸方程Y=0.0002X+?2.9815計算出1?脫氧野尻霉素含量。...
【技術特征摘要】
1.一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法，其特征在于: .1)家蠶幼蟲于-50°c下真空干燥36h，于-15°c下超微粉碎10 15 min，過80 100目篩，得到家蠶幼蟲粉； .2)取家蠶幼蟲體粉，按重量體積比為1:70(Γ800比例，加入0.05 mo I/L HC1，常溫下渦流15 20 s并超聲波處理20 30 min后，用21690 g離心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液； .3)取10UL供試液，與10 μ L 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸鉀緩沖液混和，加入20 μ L.5 mmol/L FM0C-C1液，混勻并在20°C水浴鍋中反應2...
【專利技術屬性】
技術研發人員：時連根，張作法，劉淑梅，金衛明，費建明，李玉峰，趙麗華，施國方，黃秀娣，
申請(專利權)人：浙江大學，湖州市農業科學研究院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。