一種可再生的生物素結合蛋白芯片及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種可再生的生物素結合蛋白芯片及其制備方法，特征是取雙鏈DNA，其中一條單鏈DNA的末端帶有活性基團，另一條單鏈DNA為與生物素結合蛋白相連的互補鏈，將末端帶有活性基團的單鏈DNA與具有純金膜表面的固相載體或與表面帶有活性基團的固相載體進行反應，形成物理吸附或共價連接，從而將單鏈DNA固定于固相載體表面；再通過單鏈DNA與互補鏈的堿基配對，將與互補鏈相連的生物素結合蛋白固定到固相載體表面，從而得到可再生的生物素結合蛋白芯片。該芯片比現有利用離子配對所固定的生物素結合蛋白的穩定性更好，且再生制備操作更簡易，能夠實現與現有商品化生物素結合蛋白芯片產品相同的功能；且適用于各種固相載體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于蛋白芯片及其制備方法
，具體涉及可再生的生物素結合蛋白芯片及其制備方法。
技術介紹
據《現代預防醫學》(2001,28.4:485-486)介紹，具有親和分子層表面的載體介質，如親和樹脂、生物膜和生物芯片等，因其可以特異結合帶特定結構的蛋白、多肽、DNA序列等，已被廣泛應用于蛋白質組學、細胞生物學、微生物學等領域，成為生物學的重要分析方法和手段之一。在眾多的親和分子層中，具有生物素結合蛋白結構的親和芯片是較為常用的一種，它能特異性地結合帶有生物素標簽的蛋白、多肽、DNA、RNA等。但現有商品化的生物素結合蛋白芯片產品都是一次性使用的，因為其生物素結合蛋白分子層是通過共價鍵結合的方式固定到載體介質上的，如要進行再生處理，必須采用強氧化劑(如濃硫酸、硝酸、高氯酸、雙氧水等)將載體介質表面的所有基質和生物素結合蛋白分子層進行徹底的消解，然后再重新構建表面基質和生物素結合蛋白分子層，這樣的再生方法操作復雜，費時費力，成本也高，且需用到強氧化劑和有機溶劑會造成環境污染，因此現有商品化的生物素結合蛋白芯片產品一般都是不做再生處理的。中國專利申請號200910144805.2公開的《一種可再生的生物素結合蛋白分子層及其制備方法》，利用氮川三乙酸分子可通過金屬離子捕獲帶組氨酸標簽分子的特點，通過將具有氮川三乙酸結構的分子層先后在金屬離子和帶組氨酸標簽的生物素結合蛋白溶液中進行浸泡，制備出了具有生物素結合蛋白表面的分子層。由于此生物素結合蛋白分子層可以通過金屬離子螯合劑洗脫下來，因此具有可再生、可重復利用的性質。但該方法是通過螯合離子后再配對帶組氨酸標簽的生物素結合蛋白，螯合的離子本身就不是非常穩定，力口上離子配對帶組氨酸標簽的生物素結 合蛋白一般只有2-6個結合位點，因此其整體結構穩定性還不是很好，而且再生制備過程需要重復兩個步驟，即須先后在金屬離子和帶組氨酸標簽的生物素結合蛋白溶液中浸泡，再生效率尚不夠理想。
技術實現思路
本專利技術的目的是提出，以克服現有生物素結合蛋白芯片不可重復使用的缺點。本專利技術的可再生生物素結合蛋白芯片的制備方法，通過可再生的DNA配對方式固定事先經過修飾的生物素結合蛋白分子；其特征在于:取一種雙鏈DNA，其中的一條單鏈DNA的末端帶有活性基團，另一條單鏈DNA為與生物素結合蛋白相連的互補鏈；首先將末端帶有活性基團的單鏈DNA，與具有純金膜表面的固相載體，或與表面帶有活性基團的固相載體進行反應，形成物理吸附或共價連接，從而將該單鏈DNA固定于固相載體表面；再通過該單鏈DNA與互補鏈的堿基配對，將與互補鏈相連的生物素結合蛋白固定到固相載體表面，從而得到可再生的生物素結合蛋白芯片。所述生物素結合蛋白選自卵白素(Avidin)、鏈霉親和素(Streptavidin)或中性親和素(Neutravidin)0所述活性基團選自巰基(-SH)、氨基(-順2)、羧基(-C00H)或醛基(-CH0)。所述固相載體選自玻璃片、硅片、塑料片、親和樹脂、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚丙乙烯，或它們的微粒。采用本專利技術的上述方法制備得到的本專利技術的可再生的生物素結合蛋白芯片，其特征在于:該芯片的固相載體表面具有雙鏈DNA結構，其中一條單鏈DNA通過物理吸附或共價連接的方式固定在固相載體表面，另一條單鏈DNA為與生物素結合蛋白相連的互補鏈，通過單鏈DNA與互補鏈的堿基配對使得與互補鏈相連的生物素結合蛋白固定在固相載體表面；所述生物素結合蛋白選自卵白素(Avidin)、鏈霉親和素(Streptavidin)或中性親和素(Neutravidin)0所述固相載體選自玻璃片、硅片、塑料片、親和樹脂、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚丙乙烯，或它們的微粒。本專利技術的制備方法由于采取先將單鏈DNA固定在固相載體表面，再利用DNA堿基互補配對的原理，把與生物素結合蛋白相連的互補鏈固定到固相載體上，制備出了具有生物素結合蛋白表面的蛋白芯片。該生物素結合蛋白芯片通過采用0.001-10M堿溶液進行沖洗，便能破壞固相載體表面的雙鏈DNA結構，使得與生物素結合蛋白相連的互補鏈被洗脫下來，再次進樣與生物素結合蛋白相連的互補鏈，便可重新制備出生物素結合蛋白芯片。因此這種生物素結合蛋白芯片具有可再生、可重復利用的性質。 本專利技術的制備方法與現有專利申請號200910144805.2的方法及其產物相比較，由于本專利技術利用了 DNA堿基互補配對的原理，其配對結合位點一般有10-80個之多，而現有技術通過螯合離子后再配對帶組氨酸標簽分子的離子配對方式一般只有2-6個結合位點，而且現有技術螯合的離子的穩定性遠不及本專利技術方法通過物理吸附或共價連接所固定的單鏈DNA，因此本專利技術的制備方法所固定的生物素結合蛋白的穩定性比現有技術利用離子配對所固定的生物素結合蛋白的穩定性更好；另外，本專利技術方法的再生制備過程只需要重復進行一個步驟，即只需洗脫后再次進樣與生物素結合蛋白相連的互補鏈，便可重新制備出生物素結合蛋白芯片，而現有技術則需要重復兩個步驟，即洗脫后在金屬離子和帶組氨酸標簽的生物素結合蛋白溶液中先后浸泡，因此本專利技術方法的再生效率比現有專利申請號200910144805.2的方法更高。相比現有技術利用螯合金屬離子后再配對帶組氨酸標簽分子的特點，采用本專利技術方法制備得到的可再生生物素結合蛋白芯片由于利用了 DNA堿基互補配對的原理，具有更好的穩定性，能夠穩定地結合帶有生物素標簽的分子，因此能夠實現與現有商品化的生物素結合蛋白芯片產品相同的功能。相比現有商品化的一次性使用的生物素結合蛋白芯片，由于是通過共價鍵結合的方式將生物素結合蛋白固定到載體上的，如要進行再生處理只能用強氧化劑將載體介質表面的所有基質和生物素結合蛋白分子層進行徹底的消解，然后再重新構建基質和生物素結合蛋白分子層，這種再生方法操作復雜，費時費力，成本也高，且需用到強氧化劑和有機溶劑從而造成環境污染；而本專利技術的可再生生物素結合蛋白芯片是通過DNA堿基互補配對的方式將生物素結合蛋白固定到載體上的，因而具有可再生、可重復利用的優點，而且再生制備過程只需要重復進行一個步驟，操作簡易，反應條件溫和，并可適用于各種固相載體。采用本專利技術的方法制備得到的生物素結合蛋白芯片可廣泛應用于生物學、醫學領域，如與表面等離子共振技術相結合，進行生物學分析或臨床診斷。附圖說明圖1為實施例1中可再生鏈霉親和素芯片的制備以及使用該芯片結合生物素和對此進行再生處理的表面等離子共振信號曲線；圖2為同一個芯片上重復實施例1中可再生鏈霉親和素芯片的制備以及使用該芯片結合生物素和對此進行再生處理的表面等離子共振信號曲線。具體實施例方式下面通過實施例對本專利技術作進一步具體說明。實施例1:本實施例 是以表面為純金膜的玻璃片來制備本專利技術的可再生生物素結合蛋白芯片。具體步驟為:第一步、取一種雙鏈DNA，其中的一條單鏈DNA (堿基序列:5’CATCTGACCTCTGTGCTGCT)的末端帶有活性基團巰基(-SH)，另一條單鏈DNA為與鏈霉親和素相連的互補鏈(堿基序列:5’ AGCAGCACAGAGGTCAGATG)；第二步、將表面為純金膜的玻璃片作為芯片的固相載體置于表面等離子共振相互作用分析儀中，然后以2 μ 1/min的流速注入含有5 μ M末端為巰基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種可再生生物素結合蛋白芯片的制備方法，通過可再生的DNA配對方式固定事先經過修飾的生物素結合蛋白分子；其特征在于：取一種雙鏈DNA，其中的一條單鏈DNA的末端帶有活性基團，另一條單鏈DNA為與生物素結合蛋白相連的互補鏈；首先將末端帶有活性基團的單鏈DNA，與具有純金膜表面的固相載體，或與表面帶有活性基團的固相載體進行反應，形成物理吸附或共價連接，從而將該單鏈DNA固定于固相載體表面；再通過該單鏈DNA與互補鏈的堿基配對，將與互補鏈相連的生物素結合蛋白固定到固相載體表面，從而得到可再生的生物素結合蛋白芯片。

【技術特征摘要】
1.一種可再生生物素結合蛋白芯片的制備方法，通過可再生的DNA配對方式固定事先經過修飾的生物素結合蛋白分子；其特征在于: 取一種雙鏈DNA，其中的一條單鏈DNA的末端帶有活性基團，另一條單鏈DNA為與生物素結合蛋白相連的互補鏈； 首先將末端帶有活性基團的單鏈DNA，與具有純金膜表面的固相載體，或與表面帶有活性基團的固相載體進行反應，形成物理吸附或共價連接，從而將該單鏈DNA固定于固相載體表面； 再通過該單鏈DNA與互補鏈的堿基配對，將與互補鏈相連的生物素結合蛋白固定到固相載體表面，從而得到可再生的生物素結合蛋白芯片。2.按權利要求1所述可再生生物素結合蛋白芯片的制備方法，特征在于所述生物素結合蛋白選自卵白素、鏈霉親和素或中性親和素。3.按權利要求1所述可再生生物素結合蛋白芯片的制備方法，特征在于所述活性基團選自巰基(-SH)、氨基(-NH2)、羧基(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：歐惠超，羅昭鋒，周宏敏，羅炎，
申請(專利權)人：中國科學技術大學，
類型：發明
國別省市：