本發(fā)明專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種干擾植物內(nèi)源CLE家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽。根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的方法，通過氨基酸置換獲得小分子多肽激素CLV3、CLE1、CLE8、CLE27的有效拮抗多肽，并通過轉(zhuǎn)基因的方法在植物中表達(dá)，實現(xiàn)對特定多肽進(jìn)行功能干擾，阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而對其進(jìn)行功能研究，并挖掘其在模式植物擬南芥及作物上的潛在應(yīng)用價值。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程領(lǐng)域，具體地涉及一種干擾植物內(nèi)源CLE家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽。
技術(shù)介紹
從上世紀(jì)90年代初高等植物第一個多肽激素一系統(tǒng)素的發(fā)現(xiàn)開始，已有來自包括擬南芥、水稻、大豆等不同植物的20余種小分子多肽激素被報道，參與包括免疫防御反應(yīng)、根瘤形成、細(xì)胞分裂、干細(xì)胞維持與分化、氣孔發(fā)生、花藥絨氈層發(fā)育、花粉-柱頭識別、花粉管導(dǎo)向及花瓣脫落等諸多重要生物學(xué)過程。從目前研究結(jié)果看，小分子多肽激素主要在近距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，通過與周邊細(xì)胞膜表面的LRR-RLK家族的受體激酶相互作用，啟動下游信號通路，參與植物發(fā)育過程中起重要作用的位置信號的建立和逆境應(yīng)答等。植物多肽激素通常由幾個到幾十個氨基酸組成，一般是由一個較大的原初蛋白經(jīng)過分泌和剪切加工產(chǎn)生。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的植物多肽激素被預(yù)測出來，人們也迫切希望對其功能有所了解。而利用目前現(xiàn)有的方法對植物多肽激素進(jìn)行功能研究還存在許多問題。例如，1:由于編碼多肽激素的基因通常較小，目前的基因突變方法如EMS誘變及T-DNA插入的方法很難突變到它們；2:由于多肽激素在植物體內(nèi)是作為信號分子發(fā)揮作用，含量通常很低，目前的技術(shù)手段很難從植物體內(nèi)分離并檢測到這些多肽激素；3:由于編碼植物多肽激素的基因通常屬于某個基因家族，其編碼的前體蛋白包含有保守的多肽編碼區(qū)，功能存在冗余，即使突變掉其中某個成員也很難看到植物有所異常，因此也無從對其功能進(jìn)行研究。CLV3/ESR(CLE)多肽激素 家族成員含有一個保守的包括12-14個氨基酸的CLE結(jié)構(gòu)域，在擬南芥、水稻、玉米、大豆、油菜、煙草和包囊線蟲等多個物種中都發(fā)現(xiàn)有CLE多肽激素的存在。擬南芥CLE家族有32個成員，CLV3是其中之一，主要參與莖尖分生組織維持，已有報道CLV3突變后莖尖分生組織干細(xì)胞數(shù)目增多，相應(yīng)的營養(yǎng)分生組織和花序及花分生組織變大，花器官如萼片、花瓣、雄蕊及心皮數(shù)目均變多。結(jié)構(gòu)域缺失實驗表明，只保留CLV3的信號肽和CLE結(jié)構(gòu)域足以行使CLV3的功能。體外合成對應(yīng)CLV3CLE結(jié)構(gòu)域12個氨基酸(N-RTVPSGPDPLHH-C)的CLV3多肽能夠行使CLV3的功能，互補(bǔ)clv3突變體的表型，說明該12個氨基酸的CLE結(jié)構(gòu)域是CLV3多肽激素的功能域。擬南芥CLE家族其他多個成員突變后沒有可見表型，過量表達(dá)該家族成員表現(xiàn)出植株變矮、叢生及根分生組織分化等類似表型，暗示該家族成員間存在功能冗余。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是建立一個有效產(chǎn)生小分子多肽激素的拮抗多肽的方法，通過轉(zhuǎn)基因?qū)μ囟ǘ嚯倪M(jìn)行功能干擾，阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而對其進(jìn)行功能研究，并挖掘其在模式植物擬南芥及作物上的潛在應(yīng)用價值。本專利技術(shù)的目的是提供一種干擾植物內(nèi)源CLE家族多肽激素的方法及可能的應(yīng)用。本專利技術(shù)的再一目的是提供小分子多肽激素CLV3的拮抗多肽。本專利技術(shù)的再一目的是提供小分子多肽激素CLEl的拮抗多肽。本專利技術(shù)的再一目的是提供小分子多肽激素CLE8的拮抗多肽。本專利技術(shù)的再一目的是提供小分子多肽激素CLE27的拮抗多肽。根據(jù)本專利技術(shù)的干擾植物內(nèi)源CLE家族多肽激素的方法，其中，所述方法包括以下步驟:(I)獲得多肽突變體突變小分子多肽激素CLV3的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域(N-RTVPSGPDPLHH-C)第六位的甘氨酸(G)分別置換為丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)后產(chǎn)生有效拮抗多肽；或者突變小分子多肽激素CLEl (N-RLSPGGPDPRHH-C)的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域第六位的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T);或者突變小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域第六位的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T);或者突變小分子多肽激素CLE`27 (N-RIVPSCPDPLHN-C)的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域第六位的半胱氨酸(C)置換為蘇氨酸(T)，(2)將步驟(I)中獲得的多肽突變體的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)。根據(jù)本專利技術(shù)的干擾植物內(nèi)源CLE家族多肽激素的方法，將CLV3多肽第六位的甘氨酸分別替換為亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和賴氨酸后在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生明顯的拮抗效應(yīng)；將CLV3多肽激素第六位的甘氨酸替換為蘇氨酸后在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生更強(qiáng)的拮抗效應(yīng)。上述方法對于植物生長點的遺傳操作有效，可以產(chǎn)生生長點變大的表型，從而導(dǎo)致花器官數(shù)目增加及果實變大，種子數(shù)目增加等。基于對CLV3多肽激素的研究表明CLE多肽中的第六位氨基酸是產(chǎn)生顯性負(fù)突變的目標(biāo)位點，即是產(chǎn)生拮抗效應(yīng)的目標(biāo)位點。進(jìn)一步，將該突變技術(shù)應(yīng)用到小分子多肽激素CLEl(N-RLSPGGPDPRHH-C)Jf CLEl第六位的甘氨酸替換為蘇氨酸，對于植物花序分生組織遺傳操作有效，能夠增大植物花序分生組織，從而導(dǎo)致植物花數(shù)目變多，相應(yīng)的果實數(shù)目變多等；應(yīng)用到小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)Jf CLE8第六位的甘氨酸替換為蘇氨酸，對于植物胚胎的遺傳操作有效，能夠改變植物胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞分裂模式，導(dǎo)致植物胚胎敗育；應(yīng)用到小分子多肽激素CLE27 (N-RlVPSCPDPLHN-C)Jf CLE27第六位的半胱氨酸替換為蘇氨酸，對于植物花瓣大小的遺傳操作有效，能夠使植物產(chǎn)生小花瓣。根據(jù)本專利技術(shù)的具體實施方式，將CLV3多肽激素的這些拮抗多肽通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)化到野生型植物中，實現(xiàn)增大營養(yǎng)分生組織和花序分生組織大小及增多花器官數(shù)目等目的。因此，將CLV3多肽激素的這些拮抗多肽通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)化到作物中具有潛在的增大營養(yǎng)分生組織和花序分生組織大小及花器官數(shù)目等應(yīng)用價值。對于小分子多肽激素CLEl (N-RLSPGGPDPRHH-C)，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T)，通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)化到野生型植物中，實現(xiàn)增大花序分生組織的目的。對于小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T)，通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)化到野生型植物中，可以導(dǎo)致胚胎敗育。對于小分子多肽激素CLE27(N-RIVPSCPDPLHN-C)，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸(C)置換為蘇氨酸(T)，通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)化到野生型植物中，能夠?qū)е禄ò昙?xì)胞變小，最終導(dǎo)致花瓣變小。因此，根據(jù)本專利技術(shù)的CLV3的拮抗多肽，通過將置換其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域(N-RTVPSGPDPLHH-C)第六位的甘氨酸(G)而獲得，其中，CLE結(jié)構(gòu)域的甘氨酸(G)可以分別置換為丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
干擾植物內(nèi)源多肽激素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：（1）將CLV3多肽激素的第六位的甘氨酸分別置換為丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，所述CLV3多肽激素的序列為N?RTVPSGPDPLHH?C，突變小分子多肽激素CLE1：N?RLSPGGPDPRHH?C的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的甘氨酸置換為蘇氨酸；或者突變小分子多肽激素CLE27：N?RIVPSCPDPLHN?C的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸置換為蘇氨酸，（2）通過轉(zhuǎn)基因方法將步驟（1）中獲得的多肽突變體通過轉(zhuǎn)基因方法在植物中表達(dá)。
【技術(shù)特征摘要】
1.擾植物內(nèi)源多肽激素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將CLV3多肽激素的第六位的甘氨酸分別置換為丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，所述CLV3多肽激素的序列為N-RTVPSGPDPLHH-C, 突變小分子多肽激素CLEl:N-RLSPGGPDPRHH-C的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的甘氨酸置換為蘇氨酸；或者 突變小分子多肽激素CLE27:N-RIVPSCPDPLHN-C的多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域，將其多肽編碼區(qū)CLE結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸置換為蘇氨酸， (2)通過轉(zhuǎn)基因方法將步驟(I)中獲得的多肽突變體通過轉(zhuǎn)基因方法在植物中表達(dá)。2.分子多肽激素CLV3的拮抗多肽，其特征在于，通過...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉春明，宋秀芬，國鵬，任仕超，徐婷婷，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院植物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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