羊獨立生長因子1B的多克隆抗體的獲取方法技術

本發明專利技術公開了一種羊獨立生長因子1B的多克隆抗體的獲取方法，利用設計的特異性引物GFI-1將羊獨立生長因子1B基因進行PCR擴增，獲得它的CDS序列；并通過特異性引物GFI-2來酶切，并構建原核表達載體，獲得原核表達載體pET32a-GFI1B；再將原核表達載體pET32a-GFI1B進行目的基因的誘導表達，獲得羊獨立生長因子1B蛋白；將羊獨立生長因子1B蛋白純化至85%以上；將純化后的羊獨立生長因子1B蛋白免疫到動物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分離血清；將血清純化后，獲得目的羊獨立生長因子1B基因的多克隆抗體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種生物技術，尤其是一種羊獨立生長因子IB的多克隆抗體的獲取方法。
技術介紹
獨立生長因子IB (growth factor independent IB GFI1B)是 GFIl 家族第二個被發現的基因，1933年，Gilks等在大鼠T細胞淋巴瘤的MOMULV的整合位點位點上第一次發現GFII基因，它位于人類基因組的1ρ22染色體。Rodel等于1998年在鼠類和人類基因組發現了 GFIlB基因，位于人類基因組的9q34.13染色體。研究顯示其是一種核轉錄抑制因子，編碼329個氨基酸，其中包含有由20個氨基酸組成的N端SNAG區域和有6個羧基端的C2H2樣鋅指區域。GFllB的兩個區域之間的部分由144個氨基酸組成FIlB主要表達于胎兒和成年人的紅細胞系以及巨核細胞系。GFIIB基因在人類紅細胞生成和分化過程中起了很重要的作用。黔北麻羊是貴州省三大優良山羊品種之一。其歷史悠久，發祥較早，適應能力強，耐粗飼，繁殖率高，產肉性能良好，膻味輕，肉鮮美可口，板皮品質優良等優點為當地群眾所喜養。羅衛星等對黔北麻羊的肉用性能和肉質特征進行研究，表明黔北麻羊肉用性能和肉質性質良好，具有很好的開發價值。目前，在GenBank數據中已經能搜索到人、牛、鼠等動物的GFIlB基因的序列，但未見羊的GFIlB基因序列。
技術實現思路
本專利技術的目的是:提供一種羊獨立生長因子IB的多克隆抗體的獲取方法，它能有效的獲得效價高、特異性好的羊獨立生長因子IB基因的多克隆抗體。本專利技術是這樣實現的:羊獨 立生長因子IB的多克隆抗體的獲取方法，利用設計的特異性引物GF1-1將羊獨立生長因子IB基因進行PCR擴增，獲得它的⑶S序列；并通過特異性引物GF1-1來酶切，并構建原核表達載體，獲得原核表達載體pET32a- GFIlB ;再將原核表達載體pET32a- GFIlB進行目的基因的誘導表達，獲得羊獨立生長因子IB蛋白；將羊獨立生長因子IB蛋白純化至85%以上；將純化后的羊獨立生長因子IB蛋白免疫到動物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分離血清；將血清純化后，獲得目的羊獨立生長因子IB的多克隆抗體；特異性弓I物GF1-1包括上游引物:5 ’ -ATGCCACGCTCCTTCCTGGT-3及下游引物:5’ - TCACTTGAGGTTGTGCTGGCT- 3’ ；特異性引物GF1-2包括上游引物:5’ -GGATCCATGCCACGCTCCTTCCT-3’(下劃線為 BamH I 位點);下游引物:5’ -GAATTCTCACTTGAGGTTGTGCTGGC-3’(下劃線為 EcoR I 位點)。為了驗證本專利技術的效果進行了如下實驗: I材料與方法 1.1試驗動物 從貴州省習水縣采集成年黔北麻羊的脾臟，液氮中保存備用。1.2試劑和載體 RNA提取試劑盒(Trizol)，血液RNA提取試劑盒購自MBI公司；LB培養基；氨芐青霉素(Amp) (100 g/L); 10 X TBE 緩沖液；DEPC 和瓊脂糖購自 SIGMA 公司；pMD18_T Vector、反轉錄試劑盒、Taq酶和dNTP購自大連TaKaRa公司；大腸桿菌TGl、BL21 (DE3)，表達載體pET32a由實驗室保存。DL2000 Marker、去離子甲酰胺、引物及其它常用試劑均購自上海生物工程有限公司。1.3總RNA的提取及質量、濃度測定 根據RNA提取試劑盒說明書用Trizol法提取黔北麻羊脾臟總RNA，用血液RNA提取試劑盒提取法提取黔北麻羊血液總RNA。用1%瓊脂凝膠糖檢測總RNA的完整性，核酸蛋白測定儀測定濃度，-80で保存備用。1.4 GFIlB 基因 cDNA 克隆 根據牛GFIlB基因cDNA序列(NM_001192920)設計特異性引物GF1-1擴增羊GFIlB基因cDNA序列。引物序列如下，上游引物:5 ’ATGCCACGCTCCTTCCTGGT-3，下游引物:5’-TCACTTGAGGTTGTGCTGGCT- 3’。以反轉錄產物2.5 u L,10XPCR BufferCMg2+ Plus)2 u L,dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 yL，上下游引物各 I y L，Taq 酶(5 U/ML) 0.4 yL，加超純水至總體積為20 UL0循環程序:95で預變性5 min ；94で變性30 S，55で退火40 S，72 V延伸60 S，35個循環；72で延伸10 min, 4 0C保存，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。進行目的片段純化，連接到pmdi8-t載體，轉化到大腸桿菌感受態細胞，載體命名為Pmdis-T-GFIib1，測序由北京諾賽公司完成。1.5原核表達載體的構建 采用DNAstar軟件對測序正確的序列進行酶切位點分析，并根據原核表達載體pET32a多克隆酶切位點序列設計ー 對帶有酶切位點的特異性引物GF1-2。序列如下，上游引物:5’ -GGATCCATGCCACGCTCCTTCCT-3’ (下劃線為 BamH I 位點)；下游引物:5’ -GAATTCTCACTTGAGGTTGTGCTGGC-3’(下劃線為EcoR I位點)。以PmdIS-T-GFIIB1質粒為模板擴增含酶切位點GFIIB序列。轉化pMD18-T載體，進行I和EcoT I雙酶切鑒定，將該載體命名為pMD18-T-GFIlB2。對 pMD18_T_GFIlB2 和 pET32a 載體進行 ^atnH I 和 EcoTP I 雙酶切，按 DNA膠回收試劑盒說明分別回收目的片段。將2段目的DNA在T4 DNA Ligase作用下于16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，轉化產物涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基，在37°C培養過夜后挑取陽性克隆，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基，37°C振搖過夜，按質粒提取試劑盒提取重組質粒，經酶切和PCR雙重鑒定，將陽性克隆測序并命名為pET32a-GFIlB。1.6目的基因的誘導表達 誘導表達參照pET32a原核表達說明書進行。誘導時做GFIlB溫度梯度、時間梯度和濃度梯度。凝膠用考馬斯亮藍R-250染色，脫色后觀察蛋白質帶型。從而確定最佳誘導溫度、時間、濃度。1.7 His-GFIlB融合蛋白純化 將陽性菌液按照1:100比例接種于200ml LB培養基中，添加50ug/mL氨芐青霉素，370C，180rpm/min 擴大培養，培養至 OD6tltl=0.4—0.8 時，加入終濃度為 0.6mM 的 IPTG，30°C，100rpm/min誘導3.5h。隨后的蛋白純化按照Qiagen公司N1-NTA argrose是用說明進行操作，分別收集50uL裂解液上清、沉淀、過柱液、Buffer C和Buffer E洗脫品進行SDS-PAGE分析。純化后蛋白保存在_80°C冰箱中。1.8 融合蛋白 GFIlB 的 Western Blot 鑒定 純化后樣品經 SDS-PAGE 電泳，250mA 轉膜 2h，BSA 封閉，一抗(Rabbit anti HIS Tag,I: 300稀釋)37°C孵育1.5h，二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG，1:5000稀釋)37°C孵育40本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種羊獨立生長因子1B的多克隆抗體的獲取方法，其特征在于：利用設計的特異性引物GFI?1將羊獨立生長因子1B基因進行PCR擴增，獲得它的CDS序列；并通過特異性引物GFI?2來酶切，并構建原核表達載體，獲得原核表達載體pET32a??GFI1B；再將原核表達載體pET32a??GFI1B進行目的基因的誘導表達，獲得羊獨立生長因子1B蛋白；將羊獨立生長因子1B蛋白純化至85%以上；將純化后的羊獨立生長因子1B蛋白免疫到動物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分離血清；將血清純化后，獲得目的羊獨立生長因子1B的多克隆抗體；特異性引物GFI?1包括上游引物：5?“?---ATGCCACGCTCCTTCCTGGT?3及下游引物：5“??TCACTTGAGGTTGTGCTGGCT??3’；特異性引物GFI?2包括上游引物：5“?GGATCCATGCCACGCTCCTTCCT?3“；下游引物：5“?GAATTCTCACTTGAGGTTGTGCTGGC?3“?。

【技術特征摘要】
1.種羊獨立生長因子IB的多克隆抗體的獲取方法，其特征在于:利用設計的特異性引物GF1-1將羊獨立生長因子IB基因進行PCR擴增，獲得它的⑶S序列；并通過特異性引物GF1-2來酶切，并構建原核表達載體，獲得原核表達載體pET32a- GFIlB ;再將原核表達載體pET32a- GFIlB進行目的基因的誘導表達，獲得羊獨立生長因子IB蛋白；將羊獨立生長因子IB蛋白純化至85%以上；將純化后的羊獨立生長因子IB蛋白免疫到動物上，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳志，羅衛星，劉若余，石照應，陳穎，楊海兵，李世功，龍國榮，宋桃偉，楊永強，蔡惠芬，張依裕，李維靜，
申請(專利權)人：貴州大學，
類型：發明
國別省市：