耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法技術

耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，屬于生物技術領域。其特征在于包括以下步驟：采集9月初的耐冬山茶果實，消毒、清洗；剝去種子的內外種皮，接種于愈傷誘導培養基；第25-28天將材料轉移至愈傷組織過渡培養基上；待愈傷組織由淡黃色變為黃色略帶一點紅色后將材料轉移至愈傷組織分化不定芽培養基內；材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用IBA浸沒處理，然后轉到MV液體培養基的紙橋上誘導生根，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養一段時間之后，幼根伸長并逐漸木質化。上述耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，為耐冬山茶大規模無性繁殖提供一種周期較短，繁殖系數較高的方法，也為山茶分子育種奠定基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體為。
技術介紹
耐冬山茶為第三紀的殘遺植物種類，因地殼運動，使得青島耐冬與外界山茶基因交流甚少，從而保留了古老而獨具特色的遺傳特性。從觀賞角度而言，耐冬山茶花色艷麗，花型優美，為青島市花；同時，其葉莖花亦可入藥，用于預防和治療多種疾病，極具醫療應用前景；不僅如此，耐冬山茶還具有很強的CO2吸收能力，且對H2S等有害氣體具有較強的抗性，故亦具有凈化空氣等環保作用，可謂全身是寶。目前生產上使用的種苗仍是以傳統方式培育為主。然而，山茶的生長速度慢，繁殖系數低，靠嫁接、扦插等傳統方式培育，完全不能滿足市場的需求。而關于山茶屬植物的組織培養，國內從20世紀80年代開始就有諸多研究工作，并取得了可喜的進展。采用山茶種子的子葉、幼齡山茶花的莖尖與帶芽莖節、成年山茶花的莖尖與帶芽莖節等，作為外植體均可獲得再生植物。現階段通過“芽生芽”這種莖段培養的方式得到耐冬山茶的例子已有，而對于耐冬山茶由愈傷組織誘導到不定芽分化的例子卻鮮有報道，也未見專利申請。
技術實現思路
針對現有技術中存在的上述問題，本專利技術的目的在于設計提供一種的技術方案，采用該方法繁殖系數較高，周期較短，同時也為山茶分子育種奠定基礎。所述的，其特征在于包括以下步驟: 1)采集9月初的耐冬山茶果實，剝去果皮，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養瓶中，加入75%酒精進行第一次消毒清洗8-12秒，然后純凈水清洗2-3遍，浙干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用； 2)再次使用75%酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用； 3)剝去種子的內外種皮,接種于愈傷誘導培養基上,培養溫度為25±2°C,光照光強為2500 3000 Lx，光照時間為10_12h/d ;所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6 mg 1^2，4-D和1.8-2.2 mg L-1 6-BA,愈傷誘導培養基中蔗糖含量為2_4%，瓊脂0.6-0.8%,滅菌前將PH調至5.7-5.9，120_125°C下滅菌20-25分鐘； 4)材料接入愈傷誘導培養基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時候誘導出的細密的愈傷組織已經在材料與培養基接觸的外圍長滿了厚實的一圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時再將長有愈傷組織的材料轉移至愈傷組織過渡培養基上，培養溫度為25±2°C，光照光強為2500 3000 Lx，光照時間為10_12h/d ;所述的愈傷組織過渡培養基為 MS 基本培養基中加入 0.1-0.15 mg L-1NAA + 2.0-2.2 mg Ll-BA ； 5)材料在愈傷組織過渡培養基內進行培養，待愈傷組織由淡黃色變為黃色略帶一點紅色后將材料轉移至愈傷組織分化不定芽培養基內，培養溫度為25±2°C，光照光強為2500 3000 Lx，光照時間為10_12h/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6 mg じ1NAA + 9-11 mg じ1 6-BA或者MS基本培養基中加入0.4-0.6mg じ1 IBA + 9-11 mg L-116-BA ; 6)材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用500-550mgL-1的IBA浸沒處理20_25min，然后轉到MV液體培養基的紙橋上在100-200 u mol m_2 s—1下誘導生根；誘導生根階段，采用MV液體培養基加入蔗糖15-20 gL-1，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養一段時間之后，幼根伸長并逐漸木質化。所述的，其特征在于步驟1)中:第一次消毒清洗時間9~10秒。所述的，其特征在于步驟2)中:再次使用75%酒精對種子表面消毒28-30秒，接著使用0.1% HgCl2浸泡8-9分鐘。所述的，其特征在于步驟3)中:光照光強為2600 2800 Lx，光照時間為llh/d ;所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.5mg じ12，4-D和1.9-2.0 mg L-11 6-BA,愈傷誘導培養基中蔗糖含量為3%，瓊脂0.7%，滅菌前將PH調至5.8，122°C下滅菌22分鐘。所述的，其特征在于步驟4)中:光照光強為2600 2800 Lx,光照時間為llh/d ;所述的愈傷組織過渡培養基為MS基本培養基中加入0.11-0.13 mg じ1NAA + 2.1 mg L-116-BA。所述的，其特征在于步驟5)中:光照光強為2600 2800 Lx,光照時間為llh/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養基為MS基本培養基中加入0.5 mgL-11 NAA + 10 mg L-11 6-BA或者MS基本培養基中加入0.5mg じ1IBA +10 mg L W-BA。所述的，其特征在于步驟6)中:材料基部用520-530mg L-11 的IBA浸沒處理21_23min ；MV液體培養基的紙橋上在120-150 V- mol ia2 s-1下誘導生根；MV液體培養基加入鹿糖16-18 g L-1。所述的2，4-D，別名:(2，4-ニ氯苯氧基)こ酸，2，4_D酸，2，4_D屬于苯氧類物質，是ー種人工合成的植物激素具有與生長素(IAA)相似的生理效應，2，4-D主要用于蔬菜開花期沾花，2，4-D因用量和濃度不同，對同一作物組織有不同的效果，濃度低時可促進坐果和無籽果實的發育，濃度稍高就會引起生長上的畸形；更高濃度可以殺死植物，作除草劑用，能夠除去多種雙子葉雜草。所述的6-BA，化學名稱:6-芐氨基腺嘌呤，別名:6_芐氨基嘌呤、細胞分裂素，6-BA具有高效、穩定、廉價和易于使用等特點，因而被廣泛采用，并且是組織培養者最喜愛的細胞分裂素。BA的主要作用是促進芽的形成，也可以誘導愈傷組織發生，可用于提高茶葉、煙草的質量及產量；蔬菜、水果的保鮮和無根豆芽的培育，明顯提高果品及葉片的品質。所述的NAA，也稱a-萘こ酸，是廣譜型植物生長調節劑，能促進細胞分裂與擴大，誘導形成不定根増加坐果，防止落果，改變雌、雄花比率等。可經葉片、樹枝的嫩表皮，種子進入到植株內，隨營養流輸導到全株。適用于谷類作物，増加分蘗，提高成穗率和千粒重；棉花減少蕾鈴脫落，增桃增重，提高質量。果樹促開花，防落果、催熟增產。瓜果類蔬菜防止落花，形成小籽果實；促進扦插枝條生根等。萘乙酸在植物組培中很是常用，但組培需要無菌環境，這就需要對萘乙酸所配的溶液進行滅菌，選用的滅菌方法很重要，因為萘乙酸屬于激素，若經過高溫蒸汽滅菌會失活，所以通常采用過濾除菌。所述的IBA，也叫吲哚丁酸，促進植物主根生長，提高發芽率，成活率，用于促使插條生根。上述耐冬山茶 愈傷組織再生植株的方法，為耐冬山茶大規模無性繁殖提供一種周期較短，繁殖系數較高的方法，也為山茶分子育種奠定基礎。具體實施例方式以下結合具體實施例對本專利技術作進一步說明。I)采集9月初的耐冬山茶果實，剝去果皮，用洗潔精搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養瓶中，加入75%酒精進行第一次消毒清洗8-12秒，然后純凈水清洗2-3遍，浙干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用； 2)再次使用75%酒精對種子表面消毒本文檔來自技高網...

【技術保護點】
耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：1）采集9月初的耐冬山茶果實，剝去果皮，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養瓶中，加入75%酒精進行第一次消毒清洗8?12秒，然后純凈水清洗2?3遍，瀝干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用；2）再次使用75％酒精對種子表面消毒25?35秒，接著使用0.1％HgCl2浸泡6?10分鐘，然后用無菌水沖洗5?6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用；3）剝去種子的內外種皮，接種于愈傷誘導培養基上，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10?12h/d；所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.4?0.6?mg?L?12,4?D?和?1.8?2.2?mg?L?1?6?BA，愈傷誘導培養基中蔗糖含量為2?4%，瓊脂0.6?0.8%，滅菌前將PH調至5.7?5.9，120?125℃下滅菌20?25分鐘；4）材料接入愈傷誘導培養基后15?18天后開始啟動，待第25?28天的時候誘導出的細密的愈傷組織已經在材料與培養基接觸的外圍長滿了厚實的一圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時再將長有愈傷組織的材料轉移至愈傷組織過渡培養基上，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10?12h/d；所述的愈傷組織過渡培養基為MS基本培養基中加入0.1?0.15?mg?L?1NAA?+?2.0?2.2?mg?L?16?BA；5）材料在愈傷組織過渡培養基內進行培養，待愈傷組織由淡黃色變為黃色略帶一點紅色后將材料轉移至愈傷組織分化不定芽培養基內，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10?12h/d；所述的愈傷組織分化不定芽培養基為MS基本培養基中加入0.4?0.6?mg?L?1NAA?+?9?11?mg?L?1?6?BA或者MS基本培養基中加入0.4?0.6?mg?L?1IBA?+?9?11?mg?L?16?BA；6）材料成型并長至3?4cm的芽條，其基部用500?550mg?L?1的IBA浸沒處理20?25min，然后轉到MV液體培養基的紙橋上在100?200?μmol?m?2?s?1下誘導生根；誘導生根階段，采用MV液體培養基加入蔗糖15?20?g?L?1，20?22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養一段時間之后，幼根伸長并逐漸木質化。...

【技術特征摘要】
1.冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)采集9月初的耐冬山茶果實，剝去果皮，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養瓶中，加入75%酒精進行第一次消毒清洗8-12秒，然后純浄水清洗2-3適，浙干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用； 2)再次使用75%酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1 % HgCl2浸泡6_10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用； 3)剝去種子的內外種皮,接種于愈傷誘導培養基上,培養溫度為25±2°C,光照光強為2500 3000 Lx，光照時間為10_12h/d ;所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6 mg じ12， 4-D和1.8-2.2 mg じ1 6-BA，愈傷誘導培養基中蔗糖含量為2_4%，瓊脂0.6-0.8%,滅菌前將PH調至5.7-5.9，120_125°C下滅菌20-25分鐘； 4)材料接入愈傷誘導培養基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時候誘導出的細密的愈傷組織已經在材料與培養基接觸的外圍長滿了厚實的ー圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時再將長有愈傷組織的材料轉移至愈傷組織過渡培養基上，培養溫度為25±2°C，光照光強為2500 3000 Lx，光照時間為10_12h/d ;所述的愈傷組織過渡培養基為MS基本培養基中加入0.1-0.15 mg じ1NAA + 2.0-2.2 mg じ16-BA ； 5)材料在愈傷組織過渡培養基內進行培養，待愈傷組織由淡黃色變為黃色略帶ー點紅色后將材料轉移至愈傷組織分化不定芽培養基內，培養溫度為25±2°C，光照光強為2500 3000 Lx，光照時間為10_12h/d ;所述的愈傷組織分化不定芽培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6 mg じ1NAA + 9-11 mg じ1 6-BA或者MS基本培養基中加入0.4-0.6mg じ1 IBA + 9-11 mg じ16-BA ; 6)材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李紀元，范正琪，李辛雷，殷恒福，吳斌，
申請(專利權)人：中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，
類型：發明
國別省市：