糖苷水解酶61家族蛋白在纖維素加工中的用途制造技術

本發明專利技術提供從嗜熱毀絲霉(Myceliophthora?thermophila)獲得的重組GH61蛋白、和編碼所述蛋白的核酸。本發明專利技術還提供從嗜熱毀絲霉上清液分離的、具有GH61蛋白活性的蛋白級分。這些制品可用于增加含纖維素的基質經歷被一種或多種纖維素酶諸如內切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或纖維二糖水解酶糖化的反應中產物的產量。在乙醇生產中GH61蛋白與纖維素酶的組合可用于分解纖維素生物質為可發酵糖類。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術總體涉及糖酵解酶及其用途的領域。更具體地，本專利技術提供來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)的GH61蛋白、和所述蛋白在從纖維素生物質產生可發酵糖類和乙醇中的用途。直量纖維素生物質是用于生成可發酵糖類的重要的可再生資源。這些糖類可用作發酵和其他代謝工藝的基質以產生生物燃料、化學化合物和其他有商業價值的終產物。雖然將糖類諸如單糖發酵為乙醇相對直接，但將纖維素生物質有效轉化為可發酵的糖類是有挑戰的。Ladisch 等人，1983, Enzyme Microb.Technol.5:82。纖維素生物質向可發酵糖類的轉化可以開始于化學、機械、酶促或其他預處理以提高纖維素對水解的敏感性。這種預處理之后可以是使用分解纖維素的酶進行的纖維素向纖維二糖、纖維寡糖、葡萄糖和其他糖類與糖聚合物的酶促轉化。這些酶總稱為“纖維素酶”，并包括內切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶和纖維二糖水解酶。專利技術概述在一個方面，本專利技術提供從嗜熱毀絲霉獲得的重組糖苷水解酶61家族(GH61)蛋白和編碼所述蛋白的核酸。本專利技術`還提供來自嗜熱毀絲霉培養物肉湯的分離和純化的GH61蛋白。這些蛋白可用于增加含纖維素的基質經歷被纖維素酶諸如內切葡聚糖酶、β_葡糖苷酶和纖維二糖水解酶之一或其組合糖化的反應的產物的產量。重組或分離的GH61蛋白的加入或存在可增加纖維素酶的產物的產量，例如，至少20%、30%、50%、70%、2倍、3倍或更多。本專利技術的一個實施方案是包含分離的或重組的GH61蛋白的組合物和用于制備這樣的組合物的方法。蛋白可從嗜熱毀絲霉分離，或可通過重組產生來獲得。提供了二十四種全長嗜熱毀絲霉GH61蛋白的氨基酸序列。本專利技術的GH61蛋白包括包含與所列的蛋白(SEQID NO:1-30)的任一種或其生物活性片段至少約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的氨基酸序列的蛋白。示例性的GH61蛋白是GH61a(SEQ ID NO:2)。其他示例性GH61蛋白包括GH61o、GH61v、GH61x、GH61b 和 GH61e(SEQ IDNO:6、13、15、16、19、30)。其他示例性的 GH61 蛋白包括 GH61f、GH61v、GH61p、GH61g 和 GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)。在一個方面，根據本專利技術的方法制備的組合物包括分離的或重組的GH61蛋白和本公開文件中列出的一種或多種纖維素酶，包括但不限于選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的纖維素酶。GH61蛋白和纖維素酶可從相同或不同的宿主細胞類型獲得。本專利技術的另一實施方案是從纖維素基質產生可發酵糖類的方法。將包含基質的漿料與包含GH61蛋白的組合物接觸，從而從基質產生可發酵糖類諸如葡萄糖和木糖。組合物還可包含選自纖維素酶蛋白(內切葡聚糖酶、葡糖苷酶、I型纖維二糖水解酶和2型纖維二糖水解酶)、酯酶、木聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶、淀粉酶和葡糖淀粉酶的一種或多種酶。基質可獲取自，例如，小麥、麥桿、高粱、玉米、大米、大麥、甘蔗渣、草、柳枝稷、玉米粒、玉米芯、玉米纖維、或其組合，以預處理的麥桿示例。可發酵糖類可被回收并用于產生終產物諸如醇(諸如乙醇或丁醇)、糖醇(諸如山梨醇)、有機酸(諸如乳酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、谷氨酸、檸檬酸或丙酸)、氨基酸(諸如甘氨酸、賴氨酸或天冬氨酸)、有機酸、烷、烯、二醇或甘油。本專利技術的另一實施方案是在用一種或多種纖維素酶的糖化反應中，通過在上述GH61蛋白的存在下進行反應來增加可發酵糖類的產量的方法。在另一個方面，本專利技術提供水解纖維素基質的方法。將基質與包含一種或多種重組GH61蛋白、一種或多種β-葡糖苷酶(BGL)以及一種或多種纖維二糖水解酶(CBH)的組合物接觸。在一些實施方案中，酶組合物基本上無內切葡聚糖酶(EG)。水解可導致葡萄糖產量比在所述GH61蛋白不存在時進行的相同反應的產量多至少20%、30%、50%、70%、2倍、3倍或更多。本專利技術的另一實施方案是從纖維素基質產生終產物的方法。在藉以產生可發酵糖類的條件下將基質與包含上述GH61蛋白的組合物接觸。然后在發酵中將可發酵糖類與微生物接觸以產生終產物，諸如以上列出的那些。該方法適于制備醇，尤其是乙醇，其中微生物是酵母。 本專利技術的其他實施方案包括:a)上述重組GH61蛋白，任選地被產生為帶有異源信號肽山)編碼GH61蛋白的核酸序列，其可以可操作地連接于異源啟動子；c)產生所述重組GH61蛋白的宿主細胞，以嗜熱毀絲霉、酵母、毛殼屬(Chaetomium)、梭孢殼屬(Thielavia)、支頂抱屬(Acremonium)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma)宿主細胞示例。本專利技術還包括重組產生的GH61蛋白在產生乙醇中的用途。GH61蛋白包括與所列的蛋白的任一種、或其具有GH61活性的片段至少60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約92 %、約93 %、約94 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %相同的氨基酸序列。在一個相關的方面，本專利技術提供編碼GH61蛋白的核酸。本專利技術還提供包含編碼本專利技術的蛋白序列(SEQ ID NO:1至30)、可操作地連接于異源啟動子的重組核酸序列的細胞。宿主細胞可以是(例如)嗜熱毀絲霉細胞或酵母細胞。在一個實施方案中，重組核酸序列包括SEQ ID NO:31 ;或SEQID NO:32至59的任一種。該細胞還可表達選自內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)的至少一種重組纖維素酶蛋白。在一個實施方案中，該細胞表達GH61蛋白和選自內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGLl)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)、和/或2型纖維二糖水解酶(CBH2)、和/或所述纖維素酶蛋白的變體的至少一種、至少兩種、或至少三種重組纖維素酶蛋白。在一個方面，本專利技術提供包含GH61蛋白(例如，SEQ ID Ν0:2)、內切葡聚糖酶(EG)、β -葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的組合物，其中GH61蛋白、EG、BGL、CBH1和CBH2的組合質量是組合物中總的無細胞的蛋白的至少約20%、40%、60%、70%、80%、90%、95%、或基本上全部。組合物中可存在的CBH1、CBH2、EG和BGL酶的一種、兩種、三種、或所有四種可以是衍生自天然存在的纖維素酶蛋白的變體。組合物還可以是包含纖維素酶蛋白的細胞培養物肉湯。在一個方面，本專利技術提供包含SEQ ID NO:3至30的任一種的GH61蛋白或其分泌片段。任選地，該蛋白包含分泌片段和相應的信號肽序列，如果存在信號肽序列的話。在一個相關的方面中，本專利技術提供與本文提供的多肽或生物片段具有至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91 %本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.08.20 US 61/375,7881.一種制造組合物的方法，包括組合以下: a)來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)的分離或重組的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶。2.一種制造組合物的方法，包括組合以下: a)來自嗜熱毀絲霉的分離或重組的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶； 其中在纖維素經歷被包含EG、BGL、CBHl和CBH2的酶組合糖化的反應中，與所述GH61蛋白不存在時的相同糖化反應相比，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量至少20%。3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述GH61蛋白是重組的。4.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述GH61蛋白通過從嗜熱毀絲霉培養物分離GH61蛋白活性而獲得。5.如權利要求1-4任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白增加所述反應中的葡萄糖的產量至少約50%。6.如權利要求5任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量至少約2 倍。7.一種制造組合物的方法，包括組合以下: a)包含與SEQID NO:1至30的任一種至少約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或約99%相同的氨基酸序列的重組產生的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶。8.一種組合物，包含: a)包含與選自由SEQID NO:1至30和SEQ ID NO:1至30的任一種的具有GH61活性的片段組成的組的序列至少約70 %、約75 %、約80 %、約85 %、約90 %、約95 %、約97 %或約99%相同的氨基酸序列的重組產生的GH61蛋白；和 b)選自內切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、I型纖維二糖水解酶(CBHl)和2型纖維二糖水解酶(CBH2)的一種或多種纖維素酶， 其中在纖維素經歷被包含EG、BGL、CBHl和CBH2的酶組合糖化的反應中，與所述GH61蛋白不存在時的相同反應相比，所述GH61蛋白增加葡萄糖的產量至少20%。9.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包含與SEQID NO:2、或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。10.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。11.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括與GH61f、GH61v、GH61p、GH61g和GH61i(SEQ ID NO:7、13、20、21、23、26)的任一種；或其具有GH61活性的片段至少95%相同的氨基酸序列。12.如權利要求8所述的組合物，其中所述GH61蛋白包括SEQID NO:1至30的任一種；或其具有GH61活性的片段。13.如權利要求8至12任一項所述的組合物，包含兩種、三種、或多于三種纖維素酶。14.如權利要求8至13任一項所述的組合物，其中所述纖維素酶是重組的。15.如權利要求8至14任一項所述的組合物，其中所述纖維素酶是真菌酶類。16.如權利要求8至15任一項所述的組合物，其中所述纖維素酶來自嗜熱毀絲霉。17.如權利要求8至16任一項所述的組合物，包括在一種宿主細胞群體中表達編碼所述GH61蛋白的基因，和在另一種宿主細胞群體中表達編碼纖維素酶的至少一種基因。18.如權利要求8至16任一項所述的組合物，包括在相同宿主細胞類型中表達編碼所述GH61蛋白的基因和編碼纖維素酶的至少一種基因。19.如權利要求17或18所述的組合物，其中所述基因編碼包含異源信號肽的GH61蛋白。20.一種從纖維素基質產生可發酵糖類的方法，包括將包含所述基質的漿料與包含GH61蛋白的組合物接觸，從而從所述基質產生可發酵糖類， 其中所述GH61蛋白包括與SEQ ID NO:1至30的任一種至少約80%、約85%、約90%、約93 %、約95 %、約97 %或約99 %相同的氨基酸序列。21.如權利要求20所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:1至30的任一種的分泌部分100%相同的氨基酸序列。22.如權利要求20或21所述的方法，其中在所述接觸之前，將所述基質預處理。23.如權利要求20至22任一項所述的方法，其中所述GH61蛋白與SEQID NO:2至少95%相同。24.如權利要求20至23任一項所述的方法，其中所述組合物包含選自酯酶、木聚糖酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶和其組合的一種或多種酶。25.如權利要求20至24任一項所述的方法，其中所述組合物包含選自EG、BGL、CBHl和CBH2的一種或多種纖維素酶。26.如權利要求20至25任一項所述的方法，其中所述基質獲取自小麥、麥桿、高粱、玉米、大米、大麥、甘蔗渣、草、柳枝稷、玉米粒、玉米芯、玉米纖維、或其組合。27.如權利要求20至26任一項所述的方法，其中所述基質獲取自麥桿。28.如權利要求20至27任一項所述的方法，其中所述可發酵糖類包括葡萄糖。29.如權利要求20至28任一項所述的方法，還包括回收所述可發酵糖類。30.如權利要求20至29任一項所述的方法，還包括從所述可發酵糖類產生終產物， 其中所述終產物包括醇(諸如乙醇或丁醇)、糖醇(諸如山梨醇)、有機酸(諸如乳酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、谷氨酸、檸檬酸或丙酸)、氨基酸(諸如甘氨酸、賴氨酸或天冬氨酸)、有機酸、烷、烯、二醇或甘油。31.如權利要求30所述的方法，其中所述醇是乙醇。32.—種用于在含纖維素的基質經歷被一種或多種纖維素酶糖化的反應中增加可發酵糖類的產量的方法，包括在包括與SEQ ID NO:1至30的任一種；或SEQ ID NO:1至30的任一種的具有GH61活性的片段至少80%相同的氨基酸序列的GH61蛋白存在下進行所述反應。33.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與SEQID NO:2、或其片段至少95%相同的氨基酸序列。34.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與GH61o、GH61v、GH61x、GH61b和GH61e(SEQ ID NO:6、13、15、16、19、30)的任一種;或所述序列的任一種的片段至少95%相同的氨基酸序列。35.如權利要求32所述的方法，其中所述GH61蛋白包括與...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蒂普納斯·貝德亞洛伊，路易斯·克拉克，奧諾拉托·坎波皮亞諾，克麗帕·拉奧，洛蘭·紹博，亞諾什·托羅克，楊劼，
申請(專利權)人：科德克希思公司，
類型：
國別省市：