細胞培養容器及使用該容器的細胞培養方法技術

孔的一對側面中的一個側面通過氣體透過膜與第1流路的一部分區間相接，另外一個側面通過氣體透過膜與第2流路的一部分區間相接。在孔內填充了細胞培養液的狀態下，通過用第1流路和第2流路相互流通特定成分濃度不同的高濃度氣體和低濃度氣體，從而在孔內形成特定成分的濃度分布。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】細胞培養容器及使用該容器的細胞培養方法
本專利技術涉及具有用于細胞培養的孔并用于在該孔內形成適合細胞培養的環境的細胞培養容器和使用該容器的細胞培養方法。這樣的細胞培養容器例如用于通過模擬生物體內的微環境來分析細胞功能和藥劑對細胞的功效。
技術介紹
在生物體內的正常組織中，由血管供給充分的氧和營養。與此相對，一般認為，在腫瘤組織內，由于沒有與癌細胞的增殖相應的血管新生以及各血管結構無序且脆弱等，因而氧或營養處于低濃度狀態。關于癌與氧或營養的低濃度的關系，一直以來被探討，最近研究尤其更為活躍。作為目前為止得到的知識已知，例如一部分癌細胞獲得了在低氧濃度區域中的耐性（例如參考非專利文獻1）。此外，非專利文獻1中，作為干細胞壁龕（niche）的重要要素之一而列舉了低氧濃度的同時，還揭示了癌細胞通過低氧濃度變為癌干細胞“樣”。這樣，作為詳細考察癌的功能的途徑之一，低氧濃度狀態下的癌細胞培養就變得很重要，有必要再現癌細胞所生存的環境。目前，細胞培養一般是在能夠保持溫度37℃、水蒸氣飽和、約5%CO2狀態的培養器內進行的。培養器內的氧濃度基本與大氣中的相同，為20%左右。此外，用低氧濃度狀態進行研究時，使用能夠將氧濃度保持在0.7%或約5%的所謂低氧濃度狀態的特別的培養器。然而，認為：在離血管較遠的癌細胞或在例如形成為10個以上的一定大小的塊的癌細胞群的周邊微環境中，在氧濃度上具有梯度。特別是關于從骨髓內朝向骨的方向，認為骨深部的氧濃度基本為0%，因而認為在同方向上存在氧濃度梯度。因此，為了培養癌細胞，有必要制作出具有低氧濃度區域內的氧濃度梯度的環境。然而，即使想在以前的細胞培養中通常使用的培養皿、燒瓶或者孔板（wellplate）等容器中形成氧濃度梯度，由于這些容器容積大、而且存在作為熱源的碳酸氣培養器、顯微鏡照明燈、熒光燈和其它電器等，因而發生以熱對流為主要原因的液體（此處為培養基）的移動，不能穩定地制作出具有氧濃度梯度的環境。與此相對，在被稱作μTAS（microTotalAnalysissystem）或微小流體控制技術（microfluidics）的研究領域中，使用應用了微細加工技術而制備的微小容器（例如容積為1μL以下）。認為如果將容器內的容積設得很微小，液體就被困在微小空間的密閉體系中，受周圍的壁的影響較大，不易流動，即使有熱源，對流的發生也被抑制。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本專利特表2004-508571號公報非專利文獻非專利文獻1：実験醫學Vol.25,No.14,P2139-2143,2007（實驗醫學Vol.25,No.14,P2139-2143,2007）非專利文獻2：島津評論66[1·2]37～44（2009.9）（島津評論66[1·2]37～44（2009.9））
技術實現思路
專利技術所要解決的課題作為使用上述微小容器制作特定成分的濃度梯度的方法，一般的方法是如專利文獻1所示的那樣使不同濃度的多個液體一邊流動一邊相接觸的方法。然而，將這種方法轉用到細胞培養上時，由于細胞培養液一直處于流動狀態，因此會發生如下問題：細胞因細胞培養液的流動而受到某些壓力（stress）、或細胞周邊微環境的液性因子隨細胞培養液的流動而流失、變成與實際的細胞周邊環境不同的環境。而且，微小容器的孔的上表面等多由PDMS（聚二甲基硅氧烷）形成。由于PDMS是氣體透過性的，因此如果是通常的細胞培養，則對在孔內維持與培養器內同樣的各氣體分壓而言是有效的。然而，由于孔內通過PDMS膜與培養器內處于平衡狀態，因此形成如低氧濃度區域中的氧濃度梯度這樣的濃度梯度是很困難的。由于以上情況，還不能在細胞培養液不流動的狀態下制作出具有低氧濃度區域中的氧濃度梯度的環境。因此，無論是模擬腫瘤周邊的微環境，還是穩定地并以良好的再現性培養與癌干細胞具有同樣的行為的細胞，還是取出變為癌干細胞樣的癌細胞，都很困難。而且，由于在白血病的研究中也不能維持低氧濃度區域中的氧濃度梯度，因此也不能模擬骨髓內微環境。為此，本專利技術的目的在于能夠穩定地制作出以氧和二氧化碳等為代表的氣體的、具有適于細胞培養的濃度區域的環境。用于解決課題的手段本專利技術的細胞培養容器包括：孔、第1流路和第2流路，所述孔形成于基體內部，具有容納細胞的空間，與使細胞培養液流通的流路相連，空間的相對的一對側面中的一個側面由允許氣體透過而不允許液體透過的第1氣體透過膜形成，一對側面中的另一個側面由允許氣體透過而不允許液體透過的第2氣體透過膜形成；所述第1流路通過第1氣體透過膜與孔相接，使含有特定成分的氣體流通；所述第2流路通過第2氣體透過膜與孔相接，流通不含特定成分或與第1流路中流通的氣體相比含有低濃度的特定成分的氣體。對本專利技術的細胞培養容器的孔體積進行考慮。在該孔中優選以其原本的規模模擬生物體內的微環境。此處，作為用于測定細胞和組織的功能的最小單位，對細胞進行考慮。如果把細胞近似地看做直徑為R的球，為了觀測2個細胞間的相互作用，孔底面需要排列2個細胞，最小成為直徑為2R的圓以上的大小。如果將細胞徑設為10μm，最小也成為直徑20μm的圓。如果高度有必要為細胞2倍的話，則最小體積為6.3×10-6mm3。另一方面，如果考慮最大體積，則為1mm×1mm×1mm=1mm3左右。如果比該體積大，細胞間就會過分分開，不能觀察到相互作用。由此，孔優選具有從6.3×10-6mm3至1mm3之間的容積。即使在該最大體積，液體也被困在微小空間的密閉體系中，受周圍的壁的影響較大，不易流動，對流的發生被抑制。實際上，實驗時是不流動的狀態，交換培養液時等的流速也充其量在10μm/sec左右。即使假設流速偏離10mm/sec級別而發生大的液體流動，雷諾數（Re）比從層流向亂流轉變的2300還要充分地小，成為層流，因此孔內液體被擴散所左右而被混合。也就是說，可以穩定地維持孔內形成的環境。優選封閉孔的上下表面的上下表面封閉部中的至少一個形成為可從外部目視確認孔內部的透明窗。這樣的話，就可以使用顯微鏡等從外部確認培養細胞的位置和狀態等。此時，可在該透明窗的內表面固定隨接觸液中的氧濃度而改變光學性質的氧監測物質。這樣的話，就可對孔中形成的氧濃度分布進行光學測定。這樣的細胞培養容器也可作為用于檢證孔中的氧濃度梯度的測試塊（testchip）而利用。作為“氧監測物質”，例如可以使用鉑卟啉等熒光色素。關于使用了鉑卟啉等的氧濃度分布的測定，將在實施例中詳述。本專利技術的細胞培養方法是包括如下步驟進行細胞培養的方法：使用本專利技術的細胞培養容器中封閉基體的孔上下表面的上下表面封閉部中的至少一個形成為可從外部目視確認孔內部的透明窗的細胞培養容器，在孔中填充細胞培養液并同時導入細胞的步驟；通過透明窗識別導入到孔中的細胞在孔內的停留位置的步驟；根據第1流路及第2流路的氣體流量與孔內形成的特定成分的濃度分布之間的預先求得的關系，設定第1流路及第2流路的氣體流量以使細胞的停留位置處的特定成分的濃度為規定濃度的步驟；和使孔內的細胞培養液保持靜止的狀態下，以在上述氣體流量設定步驟中設定的氣體流量在第1流路及第2流路中流通氣體的步驟。作為在孔內形成濃度梯度的對象的特定成分，可以列舉氧。此時，孔內的氧濃度優選小于21%。這樣的話，就可在孔內制作出近似本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.09.08 JP 2010-2006791.一種細胞培養容器，包括：孔，所述孔形成于基體內部，具有底面和側面，具有容納細胞的空間，與流通細胞培養液的流路相連，載置有細胞的所述底面為平面狀，所述空間的相對的一對側面中的一個側面由允許氣體透過而不允許液體透過的第1氣體透過膜形成，所述一對側面中的另一個側面由允許氣體透過而不允許液體透過的第2氣體透過膜形成，所述孔是將細胞培養液以與所述第1氣體透過膜、所述第2氣體透過膜、上表面以及所述底面接觸的密閉狀態填充的孔；第1流路，所述第1流路通過所述第1氣體透過膜與所述孔相接，流通含有特定成分的氣體；和第2流路，所述第2流路通過所述第2氣體透過膜與所述孔相接，流通不含特定成分或與所述第1流路中流通的氣體相比含有低濃度特定成分的氣體，根據流通所述第1流路的氣體與流通所述第2流路的氣體之間的所述特定成分的濃度差，在所述孔內的細胞培養液中的沿著所述底面的平面內形成所述特定成分的穩定的濃度梯度。2.根據權利要求1所述的細胞培養容器，其中，所述孔具有從6.3×10-6mm3到1mm3之...

【專利技術屬性】
技術研發人員：務中達也，阿部浩久，葉井正樹，明地將一，前川平，木村晉也，蘆原英司，莊子習一，川合健太郎，
申請(專利權)人：株式會社島津制作所，國立大學法人京都大學，學校法人早稻田大學，
類型：
國別省市：