本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種利用粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是修復(fù)重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法。其特征在于：將可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對多種金屬耐受力和積累量的外源基因引入植物，構(gòu)建一種對重金屬污染、有機(jī)物污染，特別是對重金屬－有機(jī)物復(fù)合污染都有較好修復(fù)作用的轉(zhuǎn)基因植物；在種植轉(zhuǎn)基因植物同時，施用粉紅粘帚霉，形成粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系，從而高效修復(fù)被污染土壤。本發(fā)明專利技術(shù)對于以下三種類型的污染土壤都有較好的修復(fù)作用:(1)有機(jī)污染物如多環(huán)芳烴，三氯乙烯、二溴乙烷等鹵代烴化合物污染土壤；(2)多種重金屬如Cd、Cr、Cu、Mn、Zn及Pb等污染的土壤；（3）重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤。其過程包括：轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建，陽性植株的篩選及培養(yǎng)，建立粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系，進(jìn)行污染土壤的修復(fù)。本發(fā)明專利技術(shù)在重金屬污染、有機(jī)物污染、重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染的土壤修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物技術(shù)及環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚 霉體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法。
技術(shù)介紹
隨著城鎮(zhèn)化、工業(yè)化、汽車尾氣排放以及農(nóng)業(yè)的集約化發(fā)展，環(huán)境問題越來越受 到人們關(guān)注，重金屬、有機(jī)物引起的土壤污染也日益成為環(huán)境、土壤科學(xué)家們研究的熱點 問題。土壤被重金屬及有機(jī)物污染后，不僅直接影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還會通過食物鏈影 響人體健康和安全。利用綠色植物清除污染物的策略，即植物修復(fù)技術(shù)具有成本低，環(huán) 境友好和可再利用等特點，是一種非常有前途的環(huán)境污染原位治理途徑。轉(zhuǎn)基因植物由于 具有更好的耐受力和積累量，可以得到更好的土壤修復(fù)效果。用轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)污染土壤， 已經(jīng)成為各國科學(xué)家研究的重點之一。
技術(shù)實現(xiàn)思路
轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系粉紅粘帚霉(C7rosea)是一種廣泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄 生菌，可以促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高植物耐旱耐澇、耐高、低溫能力，對貧瘠土地的植物生長 有較好促進(jìn)作用，且具有較好的生物防治能力，為非致病菌。粉紅粘帚霉對人、畜無毒無害， 可防治多種蔬菜病害，是一種很有價值的綠色生物農(nóng)藥。本專利技術(shù)主要應(yīng)用了粉紅粘帚霉的 促生作用。復(fù)合污染對植物造成嚴(yán)重的損害和生長抑制，所以，本團(tuán)隊提出，在種植轉(zhuǎn)基因植 物的同時施用粉紅粘帚霉，以形成轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系，可望大幅度增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因 植物對復(fù)合污染的耐受性和累積能力，從而大幅度提高轉(zhuǎn)基因植物對復(fù)合污染土壤的修復(fù) 能力。本團(tuán)隊的實驗已經(jīng)證實，用轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系可以顯著增加轉(zhuǎn)基因植物 的修復(fù)能力。盡管目前還未見粉紅粘帚霉用于污染土壤修復(fù)的報道。本團(tuán)隊自己生產(chǎn)了粉紅粘帚霉孢子制劑，可以用于污染土壤的修復(fù)。同時，也可從 市場上購買粉紅粘帚霉孢子制劑，用于修復(fù)污染土壤。2. 2轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)重金屬污染在轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)中，植物鰲合肽技術(shù)得到較多應(yīng)用。美國的Bennett等分別比較了 表達(dá)Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱苷肽合成酶(GS)或ATP硫酸化酶(APS)基 因的印度芥菜對土壤的修復(fù)效果，結(jié)果表明，表達(dá)Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱 苷肽合成酶(GS)的植株，植物鰲合肽和谷胱苷肽的水平增加，對鎘的耐受力和積累量也提 高。表達(dá)ATP硫酸化酶的植株，其谷胱苷肽和硫醇的含量均有所提高。ECS和GS植株莖葉 的重金屬累積量顯著高于野生株，其中鎘為1. 5倍，鋅為1. 5 — 2倍，對于鉻、銅、鉛，ECS植 株的累積量為野生株的2. 4 — 3倍。所有的轉(zhuǎn)基因植株從土壤中清除的重金屬量均顯著高 于野生株，土壤中鎘、鋅的減少量分別為25%和6%。上述幾種轉(zhuǎn)基因植株中，ECS植株的表現(xiàn)最佳。Li等將Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)基因在擬南芥中表達(dá)，使谷胱甘肽在莖 葉和根中的含量較野生株增加了 2 — 5倍，有效提高了植物對砷、汞的耐受力。Pomponi教授 等將擬南芥的植物鰲合肽基因在煙草中表達(dá)，提高了植株對Cd的耐受性和積累量。2007 年，美國的Banuelos等將半胱氨酸裂合酶(cpSL)和半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(SMT)基因分別轉(zhuǎn) 入印度芥菜中表達(dá)，用轉(zhuǎn)基因植株修復(fù)硒污染的土壤。結(jié)果，春季種植的轉(zhuǎn)cpSL基因的植 株對硒的累積量增加到原來的2倍，與野生型植株相比，葉子中硒濃度提高了1. 8倍。轉(zhuǎn) SMT基因的植株葉子中硒濃度比野生型植株提高了1. 7倍。秋季種植的轉(zhuǎn)SMT基因的植 株對硒的累積量是野生植株的1. 6倍，且莖、葉中硒的濃度都較高。這些結(jié)果表明，cpSL、 SMT的轉(zhuǎn)基因印度芥菜對硒的累積能力顯著提高。LeDuc等研究者分別在擬南芥和印度芥 末中同時表達(dá)ATP硫酸化酶和半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，使植株對硒的積累量提高了 4 一 9倍。 Banuelos等研究者進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因印度芥菜的大田試驗，在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)了半胱氨酸裂 合酶或半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果表明，硒的積累量提高了 1.6 — 2倍。Gasic等將擬南 芥的植物鰲合肽基因在印度芥菜中表達(dá)，提高了植株對鎘的耐受性。除了鰲合肽技術(shù)外，其它的轉(zhuǎn)基因植物也用于重金屬污染修復(fù)。日本的Yazaki K等異源表達(dá)哺乳動物的ABC轉(zhuǎn)運器基因于煙草中，可以同時提高 對有機(jī)和無機(jī)污染物的耐受性，因而，可望用于復(fù)合污染的植物修復(fù)。但是，ABC表達(dá)的不夠 穩(wěn)定。Sasaki等在擬南芥中表達(dá)細(xì)菌萊轉(zhuǎn)運蛋白基因,構(gòu)建了超級萊積累植株。Kim等在 擬南芥中表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運器AtH)R8，提高了對鎘的耐受力。2006年，美國的Lindblom等將高 親和的硫酸鹽傳輸子基因在印度芥末中表達(dá)，明顯提高了植株對Cr，Cd, V和W的耐受力。 日本科學(xué)家Sasaki等將硫桿菌的汞膜轉(zhuǎn)運蛋白在擬南芥中表達(dá)，構(gòu)建了超級耐汞植物，其 汞積累量為野生植物的2倍。Nagata等將細(xì)菌磷酸激酶基因在煙草中表達(dá)，提高了植株的 汞耐受性和積累量。轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)有機(jī)物污染三氯乙烯(TCE)等是污染量較大的有機(jī)污染物，特別是對地下水的污染較多。細(xì)胞色素 P450 2E1酶可以氧化多種污染物，包括三氯乙烯、溴乙烯、氯仿、四氯化碳及氯乙烯等，對多 種主要的土壤污染物有效，因此P450 2E1 (CYP 2E1)被認(rèn)為是增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效 率的候選基因。 美國科學(xué)家Doty等將人類細(xì)胞色素基因P450 2E1轉(zhuǎn)入煙草，用其修復(fù)污染土壤。 P450 2E1轉(zhuǎn)基因煙草對TCE的代謝能力較空白對照株提高達(dá)640倍。轉(zhuǎn)基因植株明顯增加 了對溴乙烯的攝取和脫溴作用。所以，P450 2E1植株可用于鹵化物污染的植物修復(fù)，有效 修復(fù)鹵化物污染。2006年，Rylott等在擬南芥中表達(dá)降解環(huán)三甲撐三硝胺(RDX)的細(xì)胞 色素P450，提高了其對RDX的耐受力，在含RDX環(huán)境中，莖葉及根的生長均優(yōu)于野生植株。 希臘學(xué)者Karavangeli等構(gòu)建轉(zhuǎn)基因煙草，表達(dá)玉米的谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因，提高了對對 氯乙酰苯胺除草劑的降解能力。將細(xì)菌氯兒茶酚雙加氧酶基因在擬南芥中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬 南芥表現(xiàn)出明顯高的清除兒茶酚的能力，可以用作芳香污染物的植物修復(fù)。同時表達(dá)多個基因可產(chǎn)生協(xié)同作用。Inui H等在馬鈴薯中表達(dá)人類P450基 因CYP1A1, CYP2B6, CYP2C9 和 CYP2C19。結(jié)果表明，同時轉(zhuǎn)入 CYP1A1, CYP2B6,及 CYP2C19基因的植株T1977，表現(xiàn)出對多種除草劑的交叉抵抗力；表達(dá)CYP2C19基因的植株2C9-57R2,對磺脲類藥物有較強(qiáng)耐受力；表達(dá)CYP2C9基因的植株2C19-12R1，對多種除 草劑有較強(qiáng)的交叉耐受力。上述結(jié)果表明多基因協(xié)同作用，提高了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的修復(fù)能 力。Kawahigashi等采用質(zhì)粒pIKBACH，將人類細(xì)胞色素P450的基因CYP1A1，CYP2B6,和 CYP2C19同時在水稻中表達(dá)，大幅度提高了水稻對除草劑莠去津和異丙甲草胺的耐受力，可 以對有機(jī)污染的土壤進(jìn)行植物修復(fù)。Wawrzynski等將絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、Y -谷氨酰 半胱氨酸酶基因和植物鰲合肽合成酶基因同時在植物中表達(dá)，使鎘的積累量提高8倍，而 表達(dá)單一基因的植株，鎘的累積量提高較少。這表明，同時表達(dá)多個基因，具有協(xié)同作用。美本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種利用粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是修復(fù)重金屬?有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法，其特征在于在污染土壤中種植轉(zhuǎn)基因植物并施用粉紅粘帚霉，建立粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系用以修復(fù)被污染土壤；所述的粉紅粘帚霉（Clonostachys?rosea）是一種廣泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，具有植物促生作用，可以促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高植物耐旱耐澇、耐高、低溫能力，還有較好的生物防治能力，為非致病菌；施用粉紅粘帚霉的方式是施用粉紅粘帚霉孢子制劑，特別是施用粉紅粘帚霉孢子粉劑；粉紅粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用；施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的方法有兩種：（1）、在轉(zhuǎn)基因植物苗根部區(qū)域施用粉紅粘帚霉孢子粉劑，使根部區(qū)域的孢子濃度為103?5孢子/克土壤；（2）、用粉紅粘帚霉孢子粉劑拌轉(zhuǎn)基因植物種子，拌種用孢子粉劑的孢子濃度為103?5孢子/克；所述轉(zhuǎn)基因植物是將可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對多種金屬耐受力和積累量的外源基因引入植物，從而獲得可修復(fù)重金屬和有機(jī)物復(fù)合污染土壤的轉(zhuǎn)基因植物；所述可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對多種金屬耐受力和積累量的外源基因如下：來源于哺乳動物的金屬硫蛋白（MT）基因、來源于高等植物的類MT基因或者來源于哺乳動物的細(xì)胞色素P450 2E1基因、1?氨基環(huán)丙烷?1?羧酸（ACC）脫氨基酶基因、γ?谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（γ?ECS）；所述的有機(jī)物為多環(huán)芳烴（PAHs），三氯乙烯、二溴乙烷等鹵代烴化合物；所述的重金屬為Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb；所述的污染土壤為重金屬污染的土壤，有機(jī)物污染的土壤，重金屬?有機(jī)物復(fù)合污染的土壤；所述的植物為煙草、花椰菜、紫花苜蓿、印度芥菜。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植物體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是修復(fù)重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法，其特征在于在污染土壤中種植轉(zhuǎn)基因植物并施用粉紅粘帚霉，建立粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植物體系用以修復(fù)被污染土壤； 所述的粉紅粘帚霉{Clonostachys rosea )是一種廣泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，具有植物促生作用，可以促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高植物耐旱耐澇、耐高、低溫能力，還有較好的生物防治能力，為非致病菌；施用粉紅粘帚霉的方式是施用粉紅粘帚霉孢子制劑，特別是施用粉紅粘帚霉孢子粉劑；粉紅粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用；施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的方法有兩種(I)、在轉(zhuǎn)基因植物苗根部區(qū)域施用粉紅粘帚霉孢子粉劑，使根部區(qū)域的孢子濃度為103_5孢子/克土壤；(2)、用粉紅粘帚霉孢子粉劑拌轉(zhuǎn)基因植物種子，拌種用孢子粉劑的孢子濃度為1...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張媛媛，劉均洪，張玉艷，鞏婷云，王靜，
申請(專利權(quán))人：青島科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。