本發明專利技術涉及一種脂蛋白磷脂酶A2的測定試劑及其制備方法。目的是提供的提供的試劑具有準確度高的特點；提供的制備方法具有制作方便的特點。技術方案是：一種脂蛋白磷脂酶A2的測定試劑，包括以下成份：a、脂蛋白磷脂酶A2試劑1；b、脂蛋白磷脂酶A2試劑2；c、液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品；其制備方法：1）脂蛋白磷脂酶A2試劑1：均勻混合；2）脂蛋白磷脂酶A2試劑2：（1）取懸浮液；（2）混合物反應；（3）得懸浮液；（4）調整濃度；（5）取（3）中的懸浮液加入（4）中；（6）反應；（7）加入乙醇胺；（8）離心處理；3）液體型LP-PLA2參考校準品：按配方量混合，按含量排列或在混合液中加入純品。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測脂蛋白磷脂酶A2的試劑及試劑的制備方法，特別是采用乳膠增強免疫比濁法檢測脂蛋白磷脂酶A2的試劑，可廣泛應用在醫學及生物化學
技術介紹
脂蛋白憐脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp_PLA2)又被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor_AH, PAF-AH),屬于磷脂酶家族中PLA2的一種，是絲氨酸依賴的磷脂酶。人血漿Lp-PLA2主要由成熟的巨噬細胞、單核細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、肝細胞等分泌生成，并受炎性介質的調節；Lp-PLA2的主要作用是產生二十烷酸類炎性介質、參與磷脂重建及生物膜的穩定平衡、脂蛋白的代謝、細胞信號傳遞、宿主反應、促進機體壞死組織自體消失等。Lp-PLA2是反映血管炎癥的特異性標記物，在低密度脂蛋白的氧化、促進動脈粥樣硬化以及冠心病和卒中的形成等方面發揮重要作用。Lp-PLA2水平升高是預測冠心病和卒中風險的一種獨立危險因子。其水平的增加被認為是增加患心臟病或腦卒中的機會。目前已經研制出多種Lp-PLA2抑制劑，有試驗結果表明服用高劑量的抑制劑患者病灶處Lp-PLA2降低了 80%，服用低劑量的患者Lp-PLA2降低了 52%，提示降低其含量和活性可能會阻斷或延緩斑塊炎癥的進程。從而提供給臨床醫生預防和治療心腦血管事件的新靶點，為臨床疾病的早期干預、臨床應用治療提供新思路新方向。目前檢測Lp-PLA2常用的實驗室方法有放射免疫學分析法(RIA)、化學發光免疫分析法(CLIA)、酶聯免疫法(ELISA)，放射免疫學分析法(RIA)法檢測耗時長(19 22h)，而且有放射性元素的污染，標記物穩定性差，廢棄物難以處理而使其受到限制。化學發光免疫分析法(CLIA)是利用化學發光物質經催化劑催化和氧化劑氧化，形成一個激發態的中間體，這種激發態的中間體回到穩定基態時，發出光子，利用發光信號測量儀測量光子數，從而間接測定LP-PLA2的濃度。目前市場上有管式和板式兩種試劑盒，但此法存在吖啶酯、魯米諾、異魯米諾直接標記抗體的發光效率低，標記物不穩定，這種直接標記法屬于瞬間發光型，很難保證測試結果的穩定性和重復性，而且需要特殊的檢測儀器。不便于常規實驗室開展。而利用生物素-親和素系統檢測LP-PLA2的電化學發光免疫試劑盒，需要配套昂貴的全自動電化學發光檢測儀，常規實驗室無法開展，而且給患者帶來不必要的費用，增加患者負擔。酶聯免疫法(ELISA)自動化程度不高，且受人為因素影響較大，重復性差，整個反應測定時間也很長(至少需要40分鐘)。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是克服上述
技術介紹
的不足，提供一種脂蛋白磷脂酶A2(Cholyglycine, LP-PLA2)的檢測試劑；所提供的試劑應具有準確度高、測定時間短(最多只需要10分鐘，甚至更短)、重復性好，操作簡單、適用于各種類型的全自動生化分析儀的特點；所提供的試劑制備方法應具有制作方便以及成本不高的特點。本專利技術提供的技術方案是一種脂蛋白磷脂酶A2的測定試劑，包括以下成份a、脂蛋白憐脂酶A2試劑I緩沖液10-400mmoWL pH 值為 5-10電解質 10-400mmol/L 表面活性劑0.01-10g/L 防腐劑2~4mmol/L 穩定劑4-5mmol/L反應加速劑0.01-50g/L其余是純化水該試劑I的pH值為7. 0-8. 0 ；b、脂蛋白憐脂酶A2試劑2 抗人LP-PLA2抗沐膠乳顆粒0,0001-0,05ml/ml緩沖液50mmol./+LpH值為 6.0-8.5 防腐劑1.5-3 mmo 1/L穩定劑3-5nunol/L其余是純化水；所述抗人LP-PLA2抗體膠乳顆粒，其中的羧基膠乳微球的粒徑為20_500nm ；C、液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品緩沖植SO-lOOmraol/L pH 值為 7.2-8.0防腐劑2-3moiol/L穩定劑130-173nimol/L 脂蛋白磷脂酶A2 適量其余是純化水；所述液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品包括5份形成LP-PLA2系列濃度的參考校準品；5份參考校準品中的LP-PLA2含量由低到高分別為1. 25ng/ml、2. 5ng/ml、5. 0ng/ml、10. 0ng/ml、20. 0ng/ml ;或者，所述液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品是單點高濃度的LP-PLA2參考校準品。所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)緩沖液、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(M0PS0)緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液中的一種或兩種以上任意比例的混合。所述試劑I中的緩沖液濃度20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。所述反應加速劑是聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50 )。所述反應加速劑濃度優選O. 05_30g/L。所述穩定劑是乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白、氯化鈉中的一種或兩種以上任意比例的混合。所述電解質是陰離子電解質或陽離子電解質。所述電解質優選陽離子中的氯化鈉(NaCl )，濃度為50-200mmol/L。所述表面活性劑是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑。所述非離子表面活性劑是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一種或兩種以上任意比例的混合。所述表面活性劑濃度優選O. 5-lg/L。所述抗人LP-PLA2抗體膠乳顆粒的濃度為O. 002-0. 01ml/ml。一種脂蛋白磷脂酶A2的測定試劑的制備方法，按照以下步驟進行I)脂蛋白憐脂酶A2試劑1: 按配方量將緩沖液、電解質、表面活性劑、反應加速劑、防腐劑、穩定劑以及純化水混合均勻，調PH值至7. 0-8. O ；2)脂蛋白憐脂酶A2試劑2 (I)取羧基膠乳微球用緩沖液稀釋成濃度為O. Olmg/ml的懸浮液；(2)按Iml的羧基膠乳微球懸浮液加20mgl_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDAC羧基活化劑)和40mg的N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(NHS)的比例，加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽，立即混勻后在室溫將此混合物反應15-30分鐘，不斷攪拌；(3)用緩沖液或純化水洗滌羧基膠乳微球，除去未反應的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽，并將膠乳微球在純化水中懸浮得羧基膠乳微球懸浮液，使其濃度為O. Olmg/ml ；(4)將抗人脂蛋白磷脂酶A2抗體溶于緩沖溶液中，使抗人脂蛋白磷脂酶A2抗體的蛋白質濃度為O. 25mg/ml ；(5)取步驟(3)中的羧基膠乳微球懸浮液Iml立即加入步驟(4)中的抗人脂蛋白磷脂酶A2抗體Iml ;使該混合液中羧基膠乳微球、抗人脂蛋白磷脂酶A2抗體和緩沖溶液的濃度分別為 O. 005mg/ml、0. 125本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種脂蛋白磷脂酶A2的測定試劑，包括以下成份：a、脂蛋白磷脂酶A2試劑1其余是純化水該試劑1的pH值為7.0?8.0；b、脂蛋白磷脂酶A2試劑2其余是純化水；所述抗人LP?PLA2抗體膠乳顆粒，其中的羧基膠乳微球的粒徑為20?500nm；c、液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品其余是純化水；所述液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品包括5份形成LP?PLA2系列濃度的參考校準品；5份參考校準品中的LP?PLA2含量由低到高分別為1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml；或者，所述液體型脂蛋白磷脂酶A2參考校準品是單點濃度的LP?PLA2參考校準品。FDA00002616517000011.jpg,FDA00002616517000012.jpg,FDA00002616517000013.jpg
【技術特征摘要】
2012.12.12 CN 201210536452.21.一種脂蛋白磷脂酶A2的測定試劑，包括以下成份a脂蛋白磷脂酶A2試劑I2.根據權利要求1所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)緩沖液、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(M0PS0)緩沖液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液中的一種或兩種以上任意比例的混合。3.根據權利要求2所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述試劑I中的緩沖液濃度20-200mmol/L，pH值7. 0-8. O。4.根據權利要求3所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述反應加速劑是聚乙二醇或硫酸葡聚糖。5.根據權利要求4所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述電解質是陰離子電解質或陽離子電解質。6.根據權利要求5所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述表面活性劑是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑；所述非離子表面活性劑是Theist、Tween、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚中的一種或兩種以上任意比例的混合。7.根據權利要求6所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述穩定劑是乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白、氯化鈉中的一種或兩種以上任意比例的混合。8.根據權利要求7所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑，其特征在于所述抗人LP-PLA2抗體膠乳顆粒的濃度為O. 002-0. 01ml/ml。9.權利要求1所述的一種測定脂蛋白磷脂酶A2的試劑的制備方法，按照以下步驟進1)脂蛋白磷脂酶A2試劑1:按配方量將緩沖液、電解質、表面活性劑、反應加速劑、防腐劑、穩定劑以及純化水混合均勻，調pH值至7. 0-8.0 ；2)脂蛋白磷脂酶A2試劑2:(1)取羧基膠乳微球用緩沖液稀釋成濃度為O.01mg/ml的懸浮液；(2)按Iml的羧基膠乳微...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳開華，其他發明人請求不公開姓名，
申請(專利權)人：元升生物科技上海有限公司，
類型：發明
國別省市：
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