本發明專利技術涉及一種谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定點突變。研究發現，此位點突變后得到的變體基因編碼的谷氨酸脫羧酶的熱穩定性有所增強。本發明專利技術通過在編碼野生GAD酶基因基礎上進行定點突變，提高了其對應變體酶在在60℃和70℃下的熱穩定性。隨著酶熱穩定性的提高，在工業生產過程中可以采用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度，有利于利用該酶通過生物轉化生產GABA。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學
，尤其涉及一種谷氨酸脫羧酶變體G56P基因及其用途。
技術介紹
定點突變(site-directed mutagenesis 或 site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位點上引入特定的堿基對變化的技術。它是研究蛋白質結構與功能之間的復雜關系的有力工具，也是在實驗室中改造基因的常用手段。對某個已知基因的特定堿基進行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質的結構和功能特征，有助于了解蛋白質結構和功能的關系。特別是在酶的理性設計中，或利用隨機突變等定向進化技術篩選得到具有潛力的重要氨基酸位點后，進行定點突變分析，將有利于進一步了解該位點在蛋白質結構和功能的關系中所發揮的作用。谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase,簡稱 GAD ；EC4.1.1. 15)是一種廣泛地存在于植物、動物和微生物中的氨基酸脫羧酶，它可以專一地催化L-谷氨酸的a -羧基脫羧反應生成Y-氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,簡稱GABA)。GABA是哺乳動物神經系統的一種關鍵的神經遞質抑制劑，具有抑制中樞神經系統過度興奮、解除神經緊張等生理功能。由于身心緊張會導致人體血壓升高、免疫功能失調、代謝紊亂，因此GABA對人體具有鎮靜安神、促進睡眠、健腦益智、降低血壓，改善免疫功能，延緩衰老等作用，是一種在食品和醫藥領域具有廣泛應用的天然氨基酸，已被國家衛生部批準為“新資源食品”。目前，利用谷氨酸脫羧酶或具有該酶活力的細胞進行GABA的生物制備正得到越來越多的重視。作為生物技術 富集生產GABA的關鍵酶，細菌GAD的熱穩定性一直是限制其在大規模生物反應器中應用的因素之一。細菌GAD的最適溫度一般在30 50°C之間，然而在60°C以上酶的活力下降較快。而在工業生產過程中，往往希望采用更高的操作溫度，這有利于提高反應速率、增加底物溶解度、降低體系粘度，從而提高生物催化與轉化的效率。中國專利申請200510049189. 4和中國專利申請200510049187. 5公開了一種生產Y-氛基丁酸的短乳桿菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306,對該菌株的GAD基因進行克隆，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，可實現可溶表達。但是，該基因表達的GAD在60°C及以上的環境中很快失活，不利于該酶在GABA生物制備中的應用。
技術實現思路
本專利技術所解決的技術問題首先是提供一種谷氨酸脫羧酶的變體基因，其編碼對應的變體酶在60°C和70°C下的熱穩定性有明顯提高，從而在工業生產過程中可以采用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度，有利于利用該酶通過生物轉化生產GABA。本專利技術進一步的目的是提供上述變體基因編碼的谷氨酸脫羧酶或包含上述變體基因的表達單元、重組質粒、或轉化子。為了達到上述目的，本專利技術采用的技術方案是一種谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定點突變。研究發現，此位點突變后得到的變體基因編碼的谷氨酸脫羧酶的熱穩定性有所增強。本專利技術研究的基礎是來自短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306中的GAD基因。其中短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306 已在中國專利申請 200510049189. 4 和中國專利申請200510049187. 5中公開，由浙江大學保藏在中國普通微生物保藏管理中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院)。本申請使用的是浙江大學饋贈的。經研究發現，短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC NO. 1306 中的 GAD 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，本申請將該基因第56位甘氨酸(Gly)的密碼子GGA突變為脯氨酸(Pro)的密碼子CCC，序列長度沒有變化。得到的谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一種由上述谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因編碼的谷氨酸脫羧酶。其氨基酸序列優選如SEQ ID N02所示。一種包含上述谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因的谷氨酸脫羧酶表達單元、重組質粒或轉化子。表達單元的啟動子可以為常用的T7啟動子、Iac啟動子或araBAD啟動子。在這些啟動子的作用下，突變酶可以直接在大腸桿菌宿主細胞(如BL21(DE3))中實現胞內可溶表達。本專利技術通過在編碼野生GAD酶基因基礎上進行定點突變，提高了其對應變體酶在60°C和70°C下的熱穩定性。本專利技術特異性選擇對編碼GAD第56位氨基酸殘基位點的密碼子進行替換，且采用編碼脯氨酸的密碼子替換編碼谷氨酸的密碼子、使GAD的第56位氨基酸殘基由野生型的谷氨酸突變為脯氨酸，是因為采用分子設計方法對GAD上各氨基酸殘基對GAD熱穩定性的影響進行了分析，發現第56位氨基酸殘基位點是一個對GAD的熱穩定性有重要影響的氨基酸。基于氨基酸性質與蛋白質結構和性質間的關系，研究發現在該位點采用脯氨酸替換甘氨酸可以增加GAD蛋白質結構的剛性、提高GAD對熱的穩定性。因此，設計了引物，通過定點突變方法構建了谷氨酸脫羧酶的熱穩定突變體G56P。隨著谷氨酸脫羧酶熱穩定性的提高，在工業生產過程中可以采用更高的操作溫度，以提高反應速率、增加底物溶解度，有利于利用該酶通過生物轉化生產GABA。附圖說明圖1為質粒pET28a(+)_gad的基因圖譜；圖2為突變位點Gly56在GAD三級結構中的位置圖(以球表示)；圖3為定點突變原理示意圖；圖4為野生型GAD酶基因PCR擴增產物凝膠電泳圖譜；圖5為突變酶和野生型GAD在60°C的熱穩定性；圖6為突變酶和野生型GAD在70°C的熱穩定性。具體實施例方式為進一步說明本專利技術，結合以下實施例具體說明一、 構建重組質粒將短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306培養至對數生長中期，取4. 5mL菌液IOOOOrpm離心一分鐘后棄去上清，利用試劑盒(上海生工)按說明書提取基因組 DNA。設計如下簡并引物上游簡并引物5'-cgggatccatggcffatgttRtaYggffaaac-31 (如 SEQ ID NO. 5 所示)；下游簡并引物5'-gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3;(如 SEQ ID NO. 6 所示)；其中，上游引物中的“ggatcc”為BamH I酶切位點，下游引物中的“gaattc”為EcoRI酶切位點。分別用上游引物和下游引物配對，選擇和優化不同的模板/Pfu/引物比例，退火溫度，循環次數，以所得基因組DNA為模板進行PCR，以得到擴展片段大小合適、豐度合適和非特異條帶少的PCR結果，最終通過條件的優化，得到了一個長度約為1400bp的DNA條帶。所確定的PCR 體系組成為ddH20,38. 5 u L ； 10 X Pfu buffer，5 uL ;上游引物0. 5u L ;下游引物，0. 5u L ；dNTP,4u L ;模板 DNA, 1u L ；Pfu,0. 5u L ;反應總體積為 50 u L。所用的PCR條本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列在第56位有定點突變。
【技術特征摘要】
1.一種谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列在第 56位有定點突變。2.根據權利要求1所述的谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列第56位的密碼子GGA突變為CCC。3.根據權利要求2所述的谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.權利要求1-3任一項所述的谷氨酸脫羧酶熱穩定變體G56P基因編碼的谷氨酸脫羧酶。5.根據權利要求4所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO...
【專利技術屬性】
技術研發人員：梅樂和，郁凱，胡升，黃俊，
申請(專利權)人：浙江大學寧波理工學院，
類型：發明
國別省市：
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