用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法、檢測用的試劑盒及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法、采用此方法進(jìn)行檢測的試劑盒、以及該試劑盒的制備方法，將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的甲肝抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果。本發(fā)明專利技術(shù)可以消除樣本中類風(fēng)濕因子對結(jié)果的假陽性干擾，并使酶標(biāo)甲肝抗原的過程更加快速高效，同時(shí)降低試劑盒的抗體成本。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物學(xué)
，具體涉及一種檢測甲型肝炎病毒抗體的方法、采用此方法進(jìn)行檢測的試劑盒、以及該試劑盒的制備方法。
技術(shù)介紹
甲型病毒性肝炎，簡稱甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，以肝臟炎癥病變?yōu)橹鞯膫魅静。饕ㄟ^糞-口途徑傳播，臨床上以疲乏，食欲減退，肝腫大，肝功能異常為主要表現(xiàn)，部分病例出現(xiàn)黃疸，主要表現(xiàn)為急性肝炎，無癥狀感染者常見。甲型肝炎患者糞便中帶有病原體HAV，可通過污染水和食物進(jìn)行傳播。因此對甲型肝炎病毒的檢測 可作為一項(xiàng)預(yù)防措施，防止疾病的傳播。目前對甲型肝炎病毒檢測的主要方法是甲型肝炎病毒特異性抗體的檢測，其中通過抗HAV IgM判定是否現(xiàn)癥感染，檢測HAV IgG判定既往感染。檢測兩種抗體有利于對被檢對象進(jìn)行全面判定。甲肝抗體的全面檢測不僅為臨床診斷提供依據(jù)，還能有效地篩選獻(xiàn)血員，減少醫(yī)源性甲型肝炎的發(fā)生和傳播，同時(shí)能減少檢測人員的工作量，節(jié)約成本，減少采血量,減少患者痛苦。目前臨床上多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測HAVIgM抗體。其原理為目前最為常用的IgM抗體檢測方法——捕獲法，即以抗人IgM抗體(抗人μ鏈)作為固相抗體，血清中的IgM類抗體(特異的和非特異的)可被固相抗體捕獲，再加入特異抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后，加入酶標(biāo)抗HAV抗體，最后加底物顯色。但此方法存在以下問題(I)每一批試驗(yàn)從加樣、溫育及洗板等步驟較多，操作繁瑣，時(shí)間較長，且需專門操作人員及專用儀器，難以在基層醫(yī)療單位開展。(2)檢測中需分別加入顯色成分A液與B液，一定程度上增加了勞動(dòng)強(qiáng)度與試劑盒成本。專利申請?zhí)?00710075306. 3公開了一種可在一定時(shí)間使生色物與過氧化物內(nèi)共存的顯色體系，但此體系中的關(guān)鍵組分一生色物保護(hù)劑硫代硫酸鈉，在此專利技術(shù)的pH低于6. O的酸性環(huán)境下不利于長期的穩(wěn)定,溶液體系若存在CO2、微生物或長期暴露在光照環(huán)境下也都不利于硫代硫酸鈉的穩(wěn)定，因此不能對生色物如TMB等起到有效的抗氧化保護(hù)作用。其中用于吸收紫外線的巴松-1789雖可以起到對紫外線的防護(hù)作用，但它遇金屬離子即變紅，干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此增加了配制過程中對試劑純度及操作的額外要求。(3)對甲肝IgM等進(jìn)行檢測的捕獲法易受RF (IgM類)及其他非特異IgM的干擾[I]。RF (IgM類)能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體(動(dòng)物IgG)反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)，致使檢測質(zhì)量不能很好地得到保證。且ELISA法無法做到對兩種抗體的快速同時(shí)檢測；個(gè)別膠體金法可對兩種抗體同時(shí)檢測，但由于方法學(xué)限制，靈敏度不是很高。目前利用辣根過氧化物酶(以下簡稱HRP)標(biāo)記抗體技術(shù)已比較成熟，尤其是普遍采用的過碘酸鈉法，少數(shù)學(xué)者利用HRP標(biāo)記抗原的技術(shù)過程與標(biāo)記抗體過程基本類似，例如專利申請?zhí)?00810141799. O中提到了利用酶標(biāo)抗體的方法標(biāo)記了甲肝重組抗原。但此標(biāo)記過程存在以下問題(I)標(biāo)記中需反復(fù)調(diào)節(jié)pH，且pH值調(diào)節(jié)范圍較寬，不可避免地影響酶活性；(2)標(biāo)記過程繁瑣、操作耗時(shí)；(3)標(biāo)記過程中不可避免發(fā)生酶自身的交聯(lián)；(4)標(biāo)記物不夠穩(wěn)定不易保存，反復(fù)凍融又會使標(biāo)記物活性下降。因此，以此傳統(tǒng)標(biāo)記方法制備的甲肝檢測試劑盒的質(zhì)量與穩(wěn)定性不能得到保證。目前常規(guī)的酶標(biāo)記物稀釋緩沖液對酶標(biāo)記物不能起到最大限度的保護(hù)作用，濃度較高的酶標(biāo)記物在低溫下相對穩(wěn)定，但制備工作液時(shí)需復(fù)溶或再稀釋，稀釋后保存期較短，且增加了工作量。專利申請?zhí)?00910143637. 5公開了一種維護(hù)酶標(biāo)記物穩(wěn)定性的稀釋液，但此溶液系統(tǒng)中所添加的木糖是一種帶有醛基的還原性糖，同時(shí)此系統(tǒng)中還存在大量帶有氨基基團(tuán)的甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、酶及其其它生物分子，此種混合溶液中易發(fā)生美拉德反應(yīng)一即羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))間的反應(yīng)，經(jīng)過復(fù)雜的歷程最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或稱擬黑素，所以又稱羰胺反應(yīng)(法國化學(xué)家L. C. Maillard在1912年提出)。美拉德反應(yīng)在高溫條件下進(jìn)行較快，但在長期室溫儲存條件下也可以緩慢進(jìn)行這種非酶促反應(yīng)；且此稀釋液諸多添加物都是動(dòng)物源性，使用非 動(dòng)物源性的穩(wěn)定劑以減少動(dòng)物源性原輔料的潛在危害已引起生產(chǎn)廠家的廣泛關(guān)注。因此以上保護(hù)性稀釋液不利于長期保存酶標(biāo)記物。某些診斷試劑盒的保存緩沖液出于商業(yè)原因等并未給出具體組分，給試劑盒的開發(fā)應(yīng)用帶來不便。因此應(yīng)根據(jù)酶標(biāo)抗原的分子量、酸堿性質(zhì)、疏水性等尋找有效的保存緩沖液。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法、試劑盒及其制備方法，以消除樣本中類風(fēng)濕因子對結(jié)果的假陽性干擾，并使酶標(biāo)甲肝抗原的過程更加快速高效，延長酶標(biāo)記物及試劑盒的有效期，同時(shí)降低試劑盒的抗體成本。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)的技術(shù)方案是一種用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的甲肝抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果；所述酶標(biāo)記甲肝抗原溶液采用辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，并采用以下步驟制備(I)將Ig辣根過氧化物酶溶于25ml 30ml的O. OlM磷酸鹽緩沖液中，加入70 85mg乙二胺，用O.1M鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至5. 0，所得溶液再與115 125mgl-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽混合，室溫振蕩反應(yīng)后，采用O. OlM磷酸鹽緩沖液對所得溶液進(jìn)行透析，制得氨基化辣根過氧化物酶溶液；(2)將步驟(I)制得的溶液配制成1ml、濃度為5 5. 2mg/ml的氨基化辣根過氧化物酶溶液，再向所得溶液內(nèi)加入60 85 μ I交聯(lián)劑，混勻后于室溫下反應(yīng)25 35min ；(3)將所述反應(yīng)物加入截留分子量為IOK的超濾管，并對反應(yīng)物進(jìn)行離心處理8 12min，再以O(shè). OlM的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶滯留結(jié)合物至1ml，再以同樣離心力離心8 12min,以除去過量的交聯(lián)劑，并再次復(fù)溶滯留物至Iml ；(4)加入800 1000 μ I濃度為lmg/ml的甲肝抗原溶液，并于室溫下反應(yīng)25 35min ；(5)使步驟(4)制得的溶液通過SephadexG-200層析柱,收集第一峰的產(chǎn)物，即為酶標(biāo)甲肝抗原溶液。優(yōu)選的，所述膜為硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。優(yōu)選的，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原所用交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)如下本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于：將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的甲肝抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果；所述酶標(biāo)記甲肝抗原溶液采用辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，并采用以下步驟制備：（1）將1g辣根過氧化物酶溶于25ml～30ml的0.01M磷酸鹽緩沖液中，加入70～85mg乙二胺，用0.1M鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至5.0，所得溶液再與115～125mg1?乙基?(3?二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽混合，室溫振蕩反應(yīng)后，采用0.01M磷酸鹽緩沖液對所得溶液進(jìn)行透析，制得氨基化辣根過氧化物酶溶液；（2）將步驟（1）制得的溶液配制成1ml、濃度為5～5.2mg/ml的氨基化辣根過氧化物酶溶液，再向所得溶液內(nèi)加入60～85μl交聯(lián)劑，混勻后于室溫下反應(yīng)25～35min；（3）將所述反應(yīng)物加入截留分子量為10K的超濾管，并對反應(yīng)物進(jìn)行離心處理8～12min，再以0.01M的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶滯留結(jié)合物至1ml，再以同樣離心力離心8～12min，以除去過量的交聯(lián)劑，并再次復(fù)溶滯留物至1ml；（4）加入800～1000μl濃度為1mg/ml的甲肝抗原溶液，并于室溫下反應(yīng)25～35min；（5）使步驟（4）制得的溶液通過SephadexG?200層析柱，收集第一峰的產(chǎn)物，即為酶標(biāo)甲肝抗原溶液。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于將抗人IgM與抗人IgG分別固定在膜上，加入待檢血清，待檢血清中的甲肝抗體和固定到膜上的抗人IgM與抗人IgG結(jié)合后，加入酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，最后加入顯色液顯色顯示結(jié)果； 所述酶標(biāo)記甲肝抗原溶液采用辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原溶液，并采用以下步驟制備 (1)將Ig辣根過氧化物酶溶于25ml 30ml的0.OlM磷酸鹽緩沖液中，加入70 85mg乙二胺，用0.1M鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至5. 0，所得溶液再與115 125mgl-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽混合，室溫振蕩反應(yīng)后，采用0. OlM磷酸鹽緩沖液對所得溶液進(jìn)行透析，制得氨基化辣根過氧化物酶溶液； (2)將步驟(I)制得的溶液配制成1ml、濃度為5 5.2mg/ml的氨基化辣根過氧化物酶溶液，再向所得溶液內(nèi)加入60 85iU交聯(lián)劑，混勻后于室溫下反應(yīng)25 35min ； (3)將所述反應(yīng)物加入截留分子量為IOK的超濾管，并對反應(yīng)物進(jìn)行離心處理8 12min，再以0. OlM的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶滯留結(jié)合物至1ml，再以同樣離心力離心8 12min,以除去過量的交聯(lián)劑，并再次復(fù)溶滯留物至Iml ； (4)加入800 1000ill濃度為lmg/ml的甲肝抗原溶液，并于室溫下反應(yīng)25 35min ； (5)使步驟(4)制得的溶液通過SephadexG-200層析柱，收集第一峰的產(chǎn)物，即為酶標(biāo)甲肝抗原溶液。2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述膜為硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜。3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記甲肝抗原所用交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)如下4.如權(quán)利要求1所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述顯色液為包括四甲基聯(lián)苯胺、過氧化脲、抗氧化劑綠原酸、還原劑抗壞血酸、紫外線吸收劑2-氰基-3，3- 二苯基丙烯酸異辛酯和pH5. 0的乙酸鈉緩沖溶液體系。5.如權(quán)利要求4所述的用于檢測甲型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，所述顯色液采用如下方法制得 ⑴將8. 3 8. 5g三水合乙酸鈉晶體溶于600ml超純水中，振蕩混勻，并調(diào)整溶液pH至.5.0 ； ⑵再將0. 4 1. Og四甲基聯(lián)苯胺溶于3ml無水乙醇中，制得四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液； ⑶將上述兩種溶液混合，振蕩混勻； ⑷分別將70 90mg綠原酸與70 90mg抗壞血酸、8 12ml2_氰基-3，3- 二苯基丙烯酸異辛酯、2. 5 2. 9g磷酰甘氨酸及0. 2 0. 8g過氧化脲加入到步驟(3)所得到的混合溶液中，振蕩混勻，得到所述顯色液。6.如權(quán)利要求1所述的用于檢測...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊致亭，楊金紅，武新清，王愛法，沈孝功，劉濟(jì)寧，丁建華，夏安春，
申請(專利權(quán))人：青島漢唐生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：