一種檢測(cè)螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及螺旋藻開(kāi)發(fā)應(yīng)用技術(shù)，旨在提供一種檢測(cè)螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法。該方法是用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白樣品分離后，檢測(cè)蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本發(fā)明專利技術(shù)簡(jiǎn)單、高效、可靠、成本低，不用進(jìn)行核酸測(cè)序與生物信息學(xué)比對(duì)等復(fù)雜試驗(yàn)和分析，因而適合大規(guī)模、高通量篩選。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于螺旋藻開(kāi)發(fā)應(yīng)用的技術(shù)，特別涉及一種鑒別螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法。
技術(shù)介紹
螺旋藻(Sp i ru I i na )，是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋的原核絲狀微藻，系藍(lán)藻門(Cyanophyta)> 顫藻目(OsciIlatoriales)> 顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個(gè)屬[武漢植物學(xué)研究，1997，15(4) : 369-374]。因富含優(yōu)質(zhì)蛋白和多種生物活性物質(zhì)而受到國(guó)內(nèi)外的極大關(guān)注，并已在大量研究的基礎(chǔ)上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，成為目前全球研究開(kāi)發(fā)規(guī)模最大、應(yīng)用前景最廣泛的經(jīng)濟(jì)微藻。值得指出的是，眾多的實(shí)驗(yàn)研究與長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐表明螺旋藻不同品種(系)，對(duì)溫度、光質(zhì)、光照強(qiáng)度以及培養(yǎng)液的鹽度、PH和營(yíng)養(yǎng)成分等環(huán)境因子的要求與適應(yīng)性存在顯著差異，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益也相差甚遠(yuǎn)[水生生物學(xué)報(bào)，1999，23(1): 59-64]。所以，與其它農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)一樣,選育品性兼優(yōu)的品種(系)是有效提升當(dāng)前螺旋藻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益、切實(shí)解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題的最直接而重要的途徑之一 O目前國(guó)內(nèi)外篩選適合大規(guī)模生產(chǎn)螺旋藻品種(系)的常規(guī)方法如下1、對(duì)新分離到的品種(系)進(jìn)行編號(hào)；2、在實(shí)驗(yàn)室條件下做多種環(huán)境因子的交叉組合培養(yǎng)試驗(yàn)，并根據(jù)所測(cè)定的生長(zhǎng)曲線、光合放氧和生化組成等指標(biāo)進(jìn)行初步篩選；3、對(duì)實(shí)驗(yàn)室初篩到有生產(chǎn)養(yǎng)殖潛力的候選品種(系)在不同季節(jié)、氣候及營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行養(yǎng)殖小試、中試與生產(chǎn)性試驗(yàn)，再篩選出目標(biāo)品種(系)。這一方法雖然實(shí)用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長(zhǎng)，且成本高。因此，迫切需要建立一種簡(jiǎn)單、高效、低成本的評(píng)價(jià)與篩選方法，以滿足當(dāng)前國(guó)內(nèi)外螺旋藻產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展的實(shí)際需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種簡(jiǎn)單、高效、低成本的檢測(cè)螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法。為解決技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)的解決方案是提供，包括以下步驟用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)蛋白樣品分離后,利用Quantity One分析軟件檢測(cè)蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。本專利技術(shù)具體包括下述步驟1、選用9株螺旋藻品系作為樣本，包括4株生產(chǎn)性狀好的品系ZJU0104、ZJU0105、ZJUO107 和 ZJUOl 15 ;5 株生產(chǎn)性狀不好的品系ZJU010U ZJU0102、ZJUO106, Sp-Js 和ZJUO114 ；2、試劑和儀器蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自GE Healthcare Biosciences (美國(guó))；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等購(gòu)自Amresco (美國(guó))。所用的垂直電泳系統(tǒng)和紫外-可見(jiàn)掃描分光光度計(jì)等為AmershamPharmcia Biotech (美國(guó))產(chǎn)品；冷凍干燥儀為VirTis (美國(guó))產(chǎn)品；掃描儀GS-800和Quantity One分析軟件等為Bio-Rad (美國(guó))產(chǎn)品；3、水溶性蛋白的制備取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，加入3ml Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI,0. 9% NaCl, pH 6. 8)，在_20°C冷凍1. 5h后再在4°C融化2h，如此反復(fù)凍融3次直至出現(xiàn)深藍(lán)紫色熒光。4°C下12000r/min離心20min得上清液即為螺旋藻水溶性蛋白；在上述所提的上清液中加入3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后_20°C靜置2h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液；沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后，加入適量SDS上樣緩沖液使其溶解，即制得用于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的蛋白樣品。4、SDS-PAGE 和軟件分析蛋白質(zhì)濃度測(cè)定參照Bradford [Anal Biochem, 1976, 72: 248一254]的考馬斯亮藍(lán) G-250 法進(jìn)行；蛋白質(zhì) SDS-PAGE 分析參照 Laemmli [Nature, 1970, 227: 680— 685]的方法進(jìn)行，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍(lán)至膠底部。用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，脫色后凝膠成像，利用Quantity One分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值進(jìn)行檢測(cè)分析，并根據(jù)其值利用SPSS13. O統(tǒng)計(jì)分析軟件構(gòu)建藻株間的聚類圖，構(gòu)建藻株間的聚類圖，通過(guò)聚類情況來(lái)鑒別該品系生產(chǎn)性狀的優(yōu)劣。本專利技術(shù)的有益效果是本專利技術(shù)所建立的鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀優(yōu)良品系的方法與常規(guī)方法相比，不僅簡(jiǎn)單、高效、可靠、成本低，而且不用進(jìn)行核酸測(cè)序與生物信息學(xué)比對(duì)等復(fù)雜試驗(yàn)和分析，因而適合大規(guī)模、高通量篩選。附圖說(shuō)明圖1為9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝膠圖；其中M :標(biāo)準(zhǔn)分子量；I 9 :分別對(duì)應(yīng) ZJUO10K ZJUO102, ZJUO106, Sp-Js, ZJU0114、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO107 和ZJU0115。圖2為9株用于構(gòu)建生產(chǎn)性狀鑒別標(biāo)準(zhǔn)的螺旋藻品系的聚類圖。圖3 為被鑒別藻株 NCCS、ZJU0103、Sp-Yc 和 ZJU0118 的 SDS-PAGE 凝膠圖；其中 M 標(biāo)準(zhǔn)分子量;1 4 :分別對(duì)應(yīng) I =ZJUOl 18 ；2 ZJU0103 ；3 NCCS ；4 =Sp-Yc0圖4為被鑒別藻株NCCS、ZJU0103、Sp_Yc和ZJU0118在所建鑒別標(biāo)準(zhǔn)中的歸類圖。具體實(shí)施方式蛋白質(zhì)的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于煙草、水稻、木本植物和海藻等生物的分類和鑒定等領(lǐng)域，但有關(guān)螺旋藻蛋白質(zhì)的SDS-PAGE指紋圖譜及相關(guān)分析方法在分類和鑒定等方面的應(yīng)用，卻鮮有報(bào)道。本專利技術(shù)建立了一種以檢測(cè)蛋白指紋圖譜在102kD處條帶光密度值的大小，并通過(guò)聚類來(lái)鑒別螺旋藻生產(chǎn)性狀的優(yōu)良及能否應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖的新方法。我們以9 株公知的螺旋藻 ZJUO10 K ZJU0102、ZJUO104, ZJUO105, ZJUO106,ZJUO107, Sp-Js, ZJUO114 和 ZJU0115 為對(duì)照材料，經(jīng)蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE 及利用 QuantityOne軟件檢測(cè)其蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小，并根據(jù)其大小進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9株品系可分為兩大類ZJU0104、ZJUO105, ZJUO107和ZJU0115為第I類；ZJU0101、ZJU0102、ZJU0106、Sp-Js和ZJU0114為第II類。長(zhǎng)期的科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐表明，上述第I類中的4株品系在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)優(yōu)良，而第II類中的5株品系因適應(yīng)能力差而不宜用作工廠化生產(chǎn)養(yǎng)殖。由此可見(jiàn)，蛋本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法，其特征在于，包括以下步驟：用Tris?HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白樣品分離后，利用Quantity?One分析軟件檢測(cè)蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質(zhì)電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測(cè)螺旋藻品系生產(chǎn)性狀優(yōu)劣的方法，其特征在于，包括以下步驟用TriS-HCl提取液提取得到螺旋藻細(xì)胞的水溶性蛋白，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白樣品分離后，利用Quantity One分析軟件檢測(cè)蛋白質(zhì)電泳圖譜102kD 處蛋白帶的光密度值，并根據(jù)其值構(gòu)建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質(zhì)電泳圖譜在 102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產(chǎn)性狀好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀好，適用于大規(guī)模培植生產(chǎn)；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產(chǎn)性狀不好的品系聚到一起，則說(shuō)明該品系生產(chǎn)性狀差，不適用于大規(guī)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：汪志平，于金鑫，劉新穎，呂蓓芬，馬麗芳，陳子元，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：