具有增強的3’-錯配辨別力的DNA聚合酶制造技術

本發明專利技術公開了相對于對應的未修飾的聚合酶具有增強的3′-錯配辨識力的突變型DNA聚合酶。突變型聚合酶可用于多種公開的引物延伸方法中。還公開了相關的組合物，包括可用于，例如，突變型DNA聚合酶生產的重組核酸、載體以及宿主細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本專利技術提供了具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶及它們在各種應用，包括核酸多核苷酸延伸和擴增中的用途。
技術介紹
DNA聚合酶負責基因組的復制和維護，這是在世代間(from generation togeneration)精確傳遞遺傳信息的中心職責。DNA聚合酶在細胞中的功能是作為負責DNA合成的酶。它們在有金屬活化劑如Mg2+存在的情況下，以被復制的DNA模板或多核苷酸模板支配的順序聚合脫氧核糖核苷三磷酸。在體內，DNA聚合酶參與一系列DNA合成過程，包括DNA復制、DNA修復、重組和基因擴增。在每一 DNA合成過程期間，復制DNA模板一次或最多幾次以產生相同的復制品。與此相反，在體外，DNA復制可以重復多次，例如在聚合酶鏈式反應期間(參見例如美國專利號4，683，202)。 在聚合酶鏈式反應(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一輪DNA復制的開始時添加的(參見上述美國專利號4，683，202)。后來，確認了從在高溫下生長的細菌中可獲得熱穩定DNA聚合酶，這些酶只需要添加一次(參見美國專利號4，889，818和美國專利號4，965，188)。在PCR期間使用的高溫下，這些酶沒有不可逆地失活。因此，可以進行聚合酶鏈式反應的重復循環而不需要在每一合成加成過程開始時添加新鮮的酶。DNA聚合酶特別是熱穩定聚合酶，是重組DNA研究和疾病的醫療診斷中大量技術的關鍵。特別是對于診斷應用，目標核酸序列可能僅僅是所考察(in question) DNA或RNA的一小部分，因此在不擴增的情況下可能難以檢測到目標核酸序列的存在。DNA聚合酶的總體折疊模式類似人的右手，包含手掌、手指和拇指三個獨特的亞結構域。(參見 beese 等，Science 260:352-355, 1993) ;Patel 等，Biochemistry34:5351-5363, 1995)。盡管在大小和細胞功能不同的聚合酶之間手指和拇指亞結構域的結構變化很大，但是催化性的手掌亞結構域全部都是重疊的(superimposable)。例如，在化學催化作用期間與引入的dNTP相互作用并穩定過渡態的基序A在哺乳動物pol α和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之間是重疊的，平均偏差約為IA (Wang等，Cell 89:1087-1099，1997)。在結構上基序A以主要包含疏水性殘基的反向平行β-折疊鏈起始，延續到α-螺旋。DNA聚合酶活性位點的主要氨基酸序列是特別保守的。在基序A的情況下，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO:28)保留在從數百萬年進化分離的生物體包括例如水生棲熱菌 iThormus aquaticus)、沙眼衣原體{Chlamydia trachomatis)和大腸桿菌 ipscherichiacoli)的聚合酶中。除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位點也被證明是相對易變的，能夠容納某些氨基酸取代而不顯著降低DNA聚合酶活性。(參見例如美國專利號6，602，695)。這種突變型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反應的診斷和研究應用中提供各種選擇優勢。因此，本領域需要鑒別適于突變的氨基酸位置以產生改進的聚合酶活性。本專利技術，如同本文中所述，滿足這些及其它需要。專利技術概述本文提供了相對于對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3’ -錯配辨別力的DNA聚合酶以及制備和使用這種DNA聚合酶的方法。在一些實施方案中，聚合酶是熱穩定DNA聚合酶。在一些實施方案中，DNA聚合酶是熱活性的DNA聚合酶。在一些實施方案中，DNA聚合酶源自棲熱菌種species)。在一些實施方案中，DNA聚合酶源自棲熱袍菌種{Thermotoga species)。如本文所述，根據本專利技術對應于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸可以在該位置從天然氨基酸突變，以產生相對于對應的未修飾的對照聚合酶具有增強的3’ -錯配辨別力的酶。在源自棲熱菌種的DNA聚合酶中，對應于SEQ ID NO:1的497位的天然氨基酸是F。在源自棲熱袍菌種的DNA聚合酶 中，對應于SEQ ID NO:1的497位的天然氨基酸是F。在源自其它非棲熱菌、非棲熱袍菌種的DNA聚合酶中，對應于SEQ ID N0:1的497位的氨基酸可以是F或除F以外的氨基酸，例如，Y。參見附圖說明圖1。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸是除F或Y以外的任何氨基酸，除了對應于SEQ ID NO:1的497位的對照DNA聚合酶的氨基酸是F或Y，對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的位置處的氨基酸選自G，A, V, L, I, M, W, P, S，T, C，N, Q, D, E, K, R或H。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的位置處的氨基酸選自A，G, S，T, D或K。在一些實施方案中，本專利技術的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對應于SEQ ID NO:1的497位的DNA聚合酶的氨基酸是除F以外的任何氨基酸，除了對應于SEQ ID NO:1的497位的對照DNA聚合酶的氨基酸是F，對照DNA聚合酶具有與所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，當DNA聚合酶源自棲熱菌種時，對應于SEQ ID NO:1的497位的位置處的氨基酸可以選自G，A, V, L, I, M, W, P, S，T, C，N, Q, D, E, K, R,H,或Y。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的位置處的氨基酸選自A，G,S，T, Y, D或K。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的位置處的氨基酸選自 A, G, S，T, D 或 K。在一些實施方案中，本專利技術的DNA聚合酶源自棲熱菌種，對應于SEQ ID N0:1的497位的氨基酸是在中性pH時，具有極性、不帶電荷的側鏈的氨基酸(例如，N，Q, H, S，T或Y)，具有非極性、不帶電荷的側鏈的氨基酸(除了 F以外的，例如，G，A, L, M, W, P,C，V,或I)，具有極性、帶正電荷的側鏈的氨基酸(例如，R或K)，或具有極性、帶負電荷的側鏈的氨基酸(例如，D或E)。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的具有極性的、不帶電荷的側鏈的氨基酸是S，T或Y。在一些實施方案中，對應于SEQ ID N0:1的497位的具有非極性的、不帶電荷的側鏈的氨基酸是A或G。在一些實施方案中，對應于SEQID NO:1的497位的具有極性、帶正電荷的側鏈的氨基酸是K。在一些實施方案中，對應于SEQ ID NO:1的497位的具有極性、帶負電荷的側鏈的氨基酸是D。在一些實施方案中，具有增強的3’-錯配辨別力的DNA聚合酶在聚合酶結構域中包含基序，所述基序包含A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X7-X8-Q-X9-Xltl-X11-X12-L-X13-X14-X15-L,其中X1是 H，E 或 Q ;X2 是 P，T 或 E ; X3是N或H ;X4是L或I ; X5是N或R ;X7 是 R，P，或 S ; X8 是 D，K 或 T; X9是L或本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：F賴切特，K鮑爾，TW邁爾斯，
申請(專利權)人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：
國別省市：