本發(fā)明專利技術(shù)提出一種源于Aspergillus?usamii?E001的新型B類環(huán)氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達(dá)方法，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1，相應(yīng)的氨基酸序列為SEQID?NO：2，相應(yīng)的基因命名為Aus?EH-B。手性氣相柱分析rEH對(duì)(R)-環(huán)氧氯丙烷具有良好的立體選擇性，生產(chǎn)(S)-環(huán)氧氯丙烷對(duì)映體過(guò)量值達(dá)99％。為該環(huán)氧化物水解酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)EH酶動(dòng)力學(xué)拆分法研究為生物催化技術(shù)產(chǎn)業(yè)化制備手性環(huán)氧氯丙烷提供基礎(chǔ)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及來(lái)源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株的一種新型B型環(huán)氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達(dá)，利用生物手性拆分制備手性環(huán)氧苯乙烯的方法，屬于生物工程
技術(shù)介紹
手性化合物是重要的手性配體，廣泛用于各類不對(duì)稱反應(yīng)中，特別是在藥物合成領(lǐng)域的應(yīng)用更為廣泛。手性環(huán)氧氯丙烷是一種重要的有機(jī)合成關(guān)鍵中間體，用以制備多種高光學(xué)純度藥物中間體和天然產(chǎn)物，如芳氧丙醇胺類藥物、環(huán)戊酮的衍生物、抗真菌藥(S)-霉康靈、阿伐他汀、L-肉堿等。目前，外消旋的環(huán)氧氯丙烷價(jià)廉易得，而手性環(huán)氧氯丙烷的價(jià)格昂貴，后者的報(bào)價(jià)基本在前者6倍以上，因此通過(guò)拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷制備其手性單體具有很大的工業(yè)化應(yīng)用前景。其拆分剮產(chǎn)物3-氯-1，2-丙二也是一種重要的手性合成原料。拆分外消旋環(huán)氧氯丙烷的方法可分為化學(xué)法和生物法兩類化學(xué)法通常使用昂貴的S Ien-Co催化劑，可獲得ee達(dá)到99%的(S)-環(huán)氧氯丙烷收率可達(dá)30%，其缺點(diǎn)是成本高而且環(huán)境污染嚴(yán)重。環(huán)氧化物水解酶(^Epoxide hydrolase, EC, 3.3.2·-)又稱環(huán)氧化物水合酶或環(huán)氧水化酶，是一類催化水分子立體選擇性的加成環(huán)氧化物水解為相應(yīng)1，2- 二醇的水解酶類。 在化學(xué)法和生物法制備手性純環(huán)氧化物的方法中，酶動(dòng)力學(xué)拆分法由于其高的對(duì)映體選擇一直受成為廣大研究者的重視。該酶廣泛存在于植物、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物及微生物體內(nèi)。環(huán)氧化物水解酶是一種不依賴輔因子的酶，其來(lái)源廣泛，底物譜寬廣，對(duì)映體選擇性高，具有很高的工業(yè)化應(yīng)用前景，對(duì)其研究已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。環(huán)氧化物水解酶微生物來(lái)源廣泛，但具有良好手性拆分作用的環(huán)氧化物水解酶較少，Botes等以1，2-環(huán)氧辛烷為底物從187個(gè)菌株中篩選出25個(gè)不同屬的酵母具有環(huán)氧化合物水解酶活性的菌株，Yeates等以硝基環(huán)氧苯乙烯為底物從409個(gè)菌株中篩選出45 個(gè)不同屬的酵母具有水解底物活性，但只有3個(gè)擔(dān)子菌屬菌株酵母的環(huán)氧化合物水解酶選擇性較高，即毛孢子菌屬(Trichosporon)、紅冬孢子屬(Rhodosporidium)和紅酵母屬 (Rhodotorula)。Furstoss 和 Archelas 等從眾多菌株中篩選一株 Aspergillus niger LCP 521進(jìn)行環(huán)氧化合物的不對(duì)稱水解，合成了 6，7_雙羥基香葉醇。目前對(duì)于環(huán)氧化物水解酶的研究，主要集中于對(duì)原始菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化以增加產(chǎn)酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)提高環(huán)氧化物水解酶的立體選擇性。 本專利技術(shù)來(lái)源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株具有環(huán)氧化物水解酶酶活性，提供一種新型B型環(huán)氧化物水解酶(Aus EH-B)基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達(dá)。基因工程環(huán)氧化物水解酶純度高、不含其他蛋白酶，立體選擇性更強(qiáng)；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有高效胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白，成本低廉、生產(chǎn)率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)；且由于一般底物為有機(jī)溶劑，酶分子受底物濃度抑制作用，胞內(nèi)表達(dá)宿主菌包膜形成天然保護(hù)屏障，更有利于在高底物濃度下進(jìn)行生物催化，適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)要求；本專利技術(shù)利用重組環(huán)氧化物水解酶制備手性環(huán)氧苯乙烯的研究未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種源于Aspergillus usamii EOOl的新型B類環(huán)氧化物水解酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及原核表達(dá)，利用重組環(huán)氧化物水解酶制備手性環(huán)氧苯乙烯的方法，為該環(huán)氧化物水解酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。根據(jù)酶的亞細(xì)胞定位及底物的特異性將EH分為可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)、微粒體環(huán)氧化物水解酶(mEH)， 保幼激素環(huán)氧化物水解酶(JhEH)，膽固醇環(huán)氧化物水懈酶(ChEH)，羥環(huán)氧烯酸水解酶 (hepoxi I inhydrolase),白三烯A4水解酶(LAH)以及朽1檬烯水解酶(LEH)七個(gè)亞家族。 生物信息學(xué)分析表明，來(lái)源于宇佐美曲霉EOOl菌株的一種新型環(huán)氧化物水解酶屬于微粒體環(huán)氧化物水解酶(mEH)類，屬于曲霉EH中一類新型環(huán)氧化物水解酶。由于與研究較多 A. Niger LCP521EH同源性僅為56 %，將該酶命名為Aus EH-B，其相應(yīng)的基因命名為Aus EH-B。Aus EH-B具有較高的催化活性和手性選擇性，在手性環(huán)氧化物生產(chǎn)中有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。A. usamii EOOl菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公開(kāi)，本專利技術(shù)人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。本專利技術(shù)的技術(shù)方案一種源自A. usamii EOOl的新型的B類環(huán)氧化物水解酶(Aus EH-B)，其基因(Aus EH-B)成熟肽cDNA核苷酸序列為SEQ ID Ν01ο所述的由成熟肽cDNA序列所推導(dǎo)的Aus EH-B氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組Aus EH-B的活性測(cè)定方法 在1. 5mLEP管中各加入O. 85mL磷酸鉀緩沖液(pH7. O)稀釋適當(dāng)重組酶菌液，在 30°C下預(yù)溫5min，然后各加入150 μ L200mM環(huán)氧氯丙烷立即記時(shí)反應(yīng)20min后。取ImL轉(zhuǎn)化液加適量無(wú)水硫酸鈉，振蕩后離心(12000r/min，5min)，取上清液進(jìn)行手性氣相分析。酶活單位定義30°C下，每分鐘催化IymoL外消旋環(huán)氧氯丙烷所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)，環(huán)氧化物水解酶酶活力以每毫克干菌體所含有的酶活力單位表示(U/mg)。所述的Aus EH-B成熟肽cDNA序列的克隆和表達(dá)的方法如下(I)從已克隆的A. usamii EOOl基因cDNA序列，然后對(duì)該序列進(jìn)行開(kāi)放讀碼框分析和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下AuEHB-F 5/ -GAATTCATGGCACTCGCTTACAGCAA-3'，含 EcoR I 酶切位點(diǎn)；AuEHB-R 5/ -GCGGCCGCTCATTTTCTACCAGCCCATAC-3;，含 Not I 酶切位點(diǎn)；提取A. usamii EOOl 的總 RNA,按照 TaKaRa 生產(chǎn)的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O 中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR :以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈;以 M13Primer M4 和 AuEHB-F 為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94°C，2min ;94°C，30s，51°C，30s， 72°C，80s, 30個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin)；以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板、AuEHB-F和AuEHB-R為引物進(jìn)行第二輪PCR(94°C，2min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，70s，30 個(gè)循環(huán)；72°C, lOmin);將兩輪PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，250bp DNA LadderMarker做對(duì)照,將目的條帶割膠回收并與PUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109獲重組質(zhì)粒pUCm-T-AusEH-B，經(jīng)酶切鑒定后送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定，得到Aus EH-B成熟肽cDNA序列。(2)將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-AusE本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種來(lái)源于Aspergillus?usamii?E001的新型B類環(huán)氧化物水解酶，其cDNA序列和氨基酸序列分別為SEQ?IDNO：1和SEQ?IDNO：2。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李劍芳，胡蝶，王春娟，朱天地，鄔敏辰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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