本發明專利技術公開了一株高產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉優勢菌株及其應用，具體為黑曲霉Aspergillus?nigerC112，于2012年4月23日保藏于《中國典型保藏物中心》，其保藏號為CCTCC?NO:M?2012129。本發明專利技術黑曲霉Aspergillus?nigerC112為紫外誘變后，經初篩、復篩后，獲得的遺傳穩定的突變菌株。通過適當延長黑曲霉Aspergillus?nigerC112種子培養時間，以麩皮、酵母粉等為原料，經液態發酵，可使β-葡萄糖苷酶酶活達到10IU/mL以上。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于酶工程
，具體涉及一株高效分泌β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，并涉及黑曲霉菌株產β-葡萄糖苷酶的應用。
技術介紹
β -葡萄糖苷酶(EC3. 2.1. 21，β -glucosidase)，也被稱作纖維二糖酶，能水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維三糖的水解速度較快。在纖維素酶水解纖維素的過程中，葡萄糖苷酶可水解纖維二糖，從而釋放出葡萄糖。目前，產纖維素酶的菌株中β -葡萄糖苷酶含量幾乎都很低(除黑曲霉外)，如木霉分泌的纖維素酶中β-葡萄糖苷酶含量還不到1%，遠達不到實際應用的水平，因此，β-葡萄糖苷酶成為纖維素酶降解纖維素過程中的瓶頸。除了在降解纖維素方面有著重要作用外，葡萄糖苷酶在其他領域應用也越來越廣泛，包括食品、釀酒、醫藥、化學等行業。近年來，國內外許多科`學家致力于β -葡萄糖苷酶的研究，期望更好改善纖維素酶的催化效率，利用纖維素資源。在提高產酶效率的方式中，誘變育種是一種非常有效的手段。誘變育種是利用人工誘變來誘發微生物基因突變，從而篩選出產量高、性能優良的突變體，具有速度快、收效大、方法簡單等優點。紫外線誘變等物理誘變方法以及硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)等化學誘變方法一直是學者們研究的熱點。宋小炎等人以實驗室保存的擬康氏木霉為出發菌株，經紫外誘變處理，用葡萄糖(梯度濃度)纖維素雙層平板選育，在含葡萄糖(4%)纖維素雙層平板上獲得一株葡萄糖濃度高達10%仍能產生纖維素水解透明圈的突變株UV III，培養6d，干曲的β-葡萄糖苷酶活力可達24U/g，是出發菌株的12. 6倍。王德培等人通過分離篩選和紫外誘變法，距離30W紫外燈15cm，照射時間O. 5_3min，選出一株高產纖維素酶黑曲霉菌株S13并進行了最佳固態發醉培養條件的研究，在最佳條件下，其葡萄糖苷酶活力達801. 18mg/(h · g)。蘇香萍等人以黑曲霉菌株SI為原始菌株進行紫外誘變，在15W紫外燈下，照射距離30cm左右，照射時間為9min，篩選獲得一株高產纖維素酶黑曲霉菌株S12，在pH6. 0，培養溫度28 V，培養時間96h條件下，β-葡萄糖苷酶活力相比較原始菌株酶活提高了的1. 13倍。雖然，針對黑曲霉產β _葡萄糖苷酶研究報道有許多，但其產酶效率仍然還有極大的提升潛力。紫外線作為一種常用的物理誘變劑，它的誘變頻率高，且不容易發生突變恢復。本專利技術的目的是采用紫外誘變的方式對現有黑曲霉菌株進行突變篩選，以期獲得更加穩定、高產葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。
技術實現思路
本專利技術在于提供一株高產β -葡萄糖苷酶的黑曲霉優勢菌株及其應用。一株產β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株為黑曲霉Aspergillus nigerC112，其保藏號為 CCTCCNO:M 2012129。所述的黑曲霉菌株用于產β -葡萄糖苷酶。具體是將黑曲霉Aspergillus nigerC112經液體發酵,產β_葡萄糖苷酶。所述的黑曲霉Aspergillus nigerC112產酶過程為固體平板孢子,經PDA液體培養基25-30°C活化48-72小時，按3-10%接種量，轉接入液體產酶培養基中，pH至4. 5-6. 0，26-30°C下，培養96小時至144小時。所述的PDA液體培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余為水，自然pH值。所述的液體產酶培養基為麩皮10g/L，酵母粉5g/L，硫酸銨2. 8g/L，KH2P044g/L,MgSO4 · 7H20 O. 9g/L，CaCl2O. 9g/L，吐溫 2mL/L，其余為水。 本專利技術的黑曲霉Aspergillus niger C112，2012年4月23日保藏于《中國典型保藏物中心》，地址為中國.武漢.武漢大學，其保藏號為CCTCC N0:M2012129o所述的黑曲霉菌株Aspergillus niger C112特征為菌株在FDA種子培養基上,25-30°C下培養96-144小時，菌絲體成絲絨狀或絮狀，頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀。分生孢子頭球狀，有大量分生孢子，分生孢子全面可育，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，黑褐色，無滲出液，菌落背面無色或中央略帶黃褐色淡黃色。附圖說明圖1為本專利技術黑曲霉Aspergillus nigerC112固體平板正面照片；圖2為本專利技術黑曲霉Aspergillus nigerC112固體平板背面照片；圖3為本專利技術黑曲霉Aspergillus nigerC112顯微鏡下菌絲體照片(400x)圖4為本專利技術黑曲霉Aspergillus nigerC112顯微鏡下孢子照片(400x)。具體實施例方式以下結合實施例旨在進一步說明本專利技術，而非限制本專利技術。本專利技術用黑曲霉菌株Aspergillus nigerACCC No 30786進行紫外誘變，黑曲霉菌株Aspergillus nigerACCC No 30786在PDA平板培養基上28°C培養5-7d。PDA培養基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。取平板菌種，加無菌生理鹽水洗下孢子，四層紗布過濾至盛有玻璃珠的無菌三角瓶中，28°C振蕩2h，使孢子分散，調整其濃度為106/mL。將上述的菌懸液取ImL稀釋至10' 10' 10' 1(Γ7倍后涂布平板，然后再取IOmL于直徑為9cm的培養皿中，磁力攪拌下距20W紫外燈35cm，處理50min。將照射后的菌液稀釋涂布于分離平板上，在分離平板中培養2d后，開始形成單菌落。分離培養基(w/v) :土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，甘油10%,去氧膽酸鈉O. 1%，自然pH。28°C培養1. 5_2d。將平皿上分離出的單菌落用牙簽挑入篩選培養皿中，28 °C培5d后，噴灑Imol/LNa2CO3顯色，挑取黃色較深的菌株直接進行復篩。篩選培養基土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1. 5%，自然pH, p-NPGO. 1%(滅菌冷卻至60°C左右加入)。將初篩得到的酶活相對較高的菌株通過搖瓶發酵，每個菌株接I瓶，28°C培養，5d后測其β -葡萄糖苷酶酶活。產酶培養基麩皮1%，玉米芯2. 15%，酵母粉O. 5%，硫酸銨O. 68%, KH2 (PO4) O. 4%, MgSO4 · 7H20 O. 09%, CaCl2O. 09%,吐溫-802 滴 / 瓶，調節 pH 為 5. 2。將復篩得到的產酶較高的菌株進行再次復篩，每株3瓶，28°C培養，5d后測其β -葡萄糖苷酶酶活。對篩選獲得的高活性的突變株進行繼代培養，連續繼代8次，測其β -葡萄糖苷酶酶活，觀察其穩定性，獲得了酶活較高、遺傳穩定的黑曲霉Aspergillus nigerC112。連續繼代8次后，其β -葡萄糖苷酶酶活達到6. 510U/mL，相對于出發菌株提高了 49. 31%。利用pNPG法測定β -葡萄糖苷酶酶活取O.1mL稀釋了適當倍數的粗酶液，加入lmLpH4. 8的O. 05mol/L朽1檬酸緩沖溶液,于5(TC水浴預熱IOmin ;加入已預熱IOmin的O. 9mL5mmol/LpNPG溶液,計時，IOmin后立即加入ImL lmol/LNa2C03溶液終止反應加入蒸懼水定容到25m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株產β?葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株為黑曲霉AspergillusnigerC112，其保藏號為CCTCC?NO:M?2012129。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳介南，張林，劉進，陳石蘭，王義強，石彩蕊，先天敏，石旺，馬云中，
申請(專利權)人：中南林業科技大學，長沙聯美生物科技有限責任公司，常德聯合生物能源研究所，
類型：發明
國別省市：
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