一種生產(chǎn)乙醇的光合微生物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和外源乙醇脫氫酶基因。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了制備所述基因工程藍(lán)藻的載體和制備方法，以及使用所述基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及可再生能源和生物
具體涉及一種經(jīng)過基因工程修飾后可通過光合作用高效生產(chǎn)乙醇的微生物，以及所述基因工程修飾微生物的方法和運(yùn)用此基因工程微生物制備乙醇的方法。
技術(shù)介紹
進(jìn)入21世紀(jì)以來，原油價(jià)格居高不下，太陽(yáng)能、風(fēng)能、潮汐能等開發(fā)利用成本居高不下，而各國(guó)對(duì)環(huán)境保護(hù)的要求在不斷的提高，因此，如何開發(fā)替代能源的問題受到各國(guó)普遍關(guān)注。許多國(guó)家將加快發(fā)展可再生能源作為發(fā)展替代能源的重要戰(zhàn)略，生物能源是其中發(fā)展最快的領(lǐng)域。目前的液體生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速發(fā)展面臨著糧食安全和土地淡水資源緊缺問題。現(xiàn)有技術(shù)通過燃料乙醇產(chǎn)業(yè)作為替代能源，但是，隨著燃料乙醇產(chǎn)量增加，糧食供給短缺和價(jià)格上漲導(dǎo)致以糧食為原料的生物能源產(chǎn)業(yè)不能持續(xù)性發(fā)展。近幾年大力發(fā)展的非糧燃料乙醇和生物質(zhì)發(fā)電產(chǎn)業(yè)同樣受到客觀條件的制約，難以滿足大規(guī)模替代化石燃料的規(guī)模和成本要求。以木薯、甜高粱、纖維素為原料的燃料乙醇產(chǎn)業(yè)從本質(zhì)上說是以種植業(yè)為基礎(chǔ)的，需要大規(guī)模投入可耕地、淡水、化肥以獲得較高產(chǎn)量，而這些資源均為稀缺資源，用于替代化石能源將對(duì)整體資源環(huán)境造成巨大壓力。因此，迫切需要開發(fā)不占用可耕地、淡水、化肥資源的新型生物能源技術(shù)，為可再生能源產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供具備現(xiàn)實(shí)可行性的手段，切實(shí)有效減少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促進(jìn)基于化石能源的傳統(tǒng)工業(yè)體系向基于可再生能源的綠色工業(yè)體系轉(zhuǎn)化。對(duì)微生物進(jìn)行基因工程改造來生產(chǎn)能源是能源產(chǎn)業(yè)中的一個(gè)發(fā)展方向。但現(xiàn)有技術(shù)中，工業(yè)上主要是利用具有乙醇代謝途徑的異養(yǎng)微生物，例如酵母和大腸桿菌等。專利技術(shù)名稱為“基因修飾酵母物種和使用基因修飾酵母的發(fā)酵方法”的中國(guó)專利200480019052. 8公開了用外源木糖異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。額外的基因修飾增強(qiáng)了所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將木糖發(fā)酵成乙醇或者其產(chǎn)物的能力。那些修飾包括缺失非特異或特異的醛糖還原酶基因、缺失木糖醇脫氫酶基因和/或超表達(dá)木酮糖激酶。該方法可用于燃料乙醇的生產(chǎn)或用于酒精飲料的生產(chǎn)。專利技術(shù)名稱為“大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌及其應(yīng)用”的中國(guó)專利200710177003. 2公開了一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。經(jīng)多代的定向篩選得到了高耐乙醇的大腸桿菌突變株，并在所述突變株中轉(zhuǎn)入了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因I I和丙酮酸脫羧酶基因，得到了一種新型耐乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。該工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時(shí)，在高濃度乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率，而且有較高的乙醇轉(zhuǎn)化率。藍(lán)藻是一種自養(yǎng)微生物，是目前地球上最廣泛的生物體。藍(lán)藻的細(xì)胞質(zhì)中都有內(nèi)膜系統(tǒng)。藍(lán)藻的細(xì)胞質(zhì)中具原始的片層結(jié)構(gòu)，片層上分布有光合色素葉綠素和藻膽素(包括藻藍(lán)素和藻紅素兩種)及類胡蘿卜素。藍(lán)藻的葉綠素可以進(jìn)行光合作用，并且其細(xì)胞可以提供光合作用所需的能量，所以藍(lán)藻可以進(jìn)行光合作用，產(chǎn)生自己所需要的物質(zhì)，即可以自養(yǎng)。但是，自然存在的光合細(xì)菌藍(lán)藻通常不能利用陽(yáng)光和二氧化碳合成乙醇，僅在避光和無氧條件下通過發(fā)酵產(chǎn)生少量乙醇。本領(lǐng)域已知生產(chǎn)乙醇的微生物(例如大腸桿菌，酵母菌，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單細(xì)胞菌等) 中存在乙醇生產(chǎn)的代謝途徑。已知的乙醇生產(chǎn)代謝途徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經(jīng)過乙醛再到末端代謝產(chǎn)物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反應(yīng)過程由丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)催化，乙醒到乙醇的反應(yīng)過程由乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase2,ADHB)催化控制。藍(lán)藻的基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因pdc，因而不具有利用陽(yáng)光和二氧化碳產(chǎn)生乙醇的能力。本專利技術(shù)提供了一種利用基因工程藍(lán)藻生產(chǎn)乙醇的方法，經(jīng)過對(duì)野生藍(lán)藻的改造， 從而使得藍(lán)藻能夠直接利用太陽(yáng)光和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)以藍(lán)藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑的丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因?qū)胨{(lán)藻，形成具有穩(wěn)定遺傳性狀和較高乙醇產(chǎn)率的基因工程菌株，使得改造的藍(lán)藻菌株能夠利用陽(yáng)光、水和二氧化碳生產(chǎn)乙醇。本專利技術(shù)還提供了基因工程藍(lán)藻通過光合作用利用陽(yáng)光、水和二氧化碳制備乙醇的方法。本專利技術(shù)提供了一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因。外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)分別編碼具有丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶活性的蛋白。本專利技術(shù)使用的宿主是藍(lán)藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隱球藻屬 (Aphanocaps)、魚腥藻屬(Anobaena)、念珠藻屬(Nostoc)、顫藻屬(Oscillatoria)、聚球藻屬(Synechococcus)、球藻屬(Gloeocapsa)、阿格藻屬(Agmmenellumm)、雙歧藻屬 (Scytonema)或鞭枝藻屬(Mastigocladus)。本專利技術(shù)的藍(lán)藻優(yōu)選為集胞藻(Synechocystis sp.)。在本專利技術(shù)的一個(gè)方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本專利技術(shù)的基因工程藍(lán)藻含有整合到染色體上的編碼丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的核酸。丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxyla se, PDC)廣泛存在于豆類植物、麻黃等植物、釀酒酵母屬(Saccharomyces species)、曲霉屬等真菌中，另外運(yùn)動(dòng)單胞菌(Zymomonas mobilis)、醋桿菌屬(Acetobacter species)中也都含有丙酮酸脫羧酶。不同來源的丙酮酸脫羧酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對(duì)各種來源的丙酮酸脫羧酶進(jìn)行了測(cè)序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但也具有很多保守的區(qū)域和活性位點(diǎn)。其中，如Genebank報(bào)道的，運(yùn)動(dòng)單胞菌的丙酮酸脫羧酶具有如SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQ ID NO. 2的核酸序列。不同來源的丙酮酸脫羧酶的序列有所區(qū)別，但都具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位點(diǎn)。乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)大量存在于人和動(dòng)物肝臟、植物及微生物細(xì)胞之中，是一種含鋅金屬酶，具有廣泛的底物特異性，其分子由兩個(gè)亞基組成，其中一個(gè)位于酶的活性中心，另一個(gè)起穩(wěn)定四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。乙醇脫氫酶夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為輔酶，催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)CH3CH2OH+NAD+ — CH3CHO+NADH+H+。在人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，乙醇脫氫酶與乙醛脫氫酶(ALDH)構(gòu)成了乙醇脫氫酶系，參與體內(nèi)乙醇代謝。酵母和細(xì)菌(乳酸菌，以及某些條件下的大腸桿菌除外)不將葡萄糖發(fā)酵為乳酸，而是將葡萄糖發(fā)酵為乙醇和二氧化碳。總反應(yīng)式為Glucose+2ADP+2Pi —2ethanol+2C02+2ATP+2H20。在酵母和許多細(xì)菌中，乙醇脫氫酶在發(fā)酵起著重要作用從糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛和二氧化碳，隨后乙醛在ADHI的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇。后一步的目的是重新產(chǎn)生NAD+，于是糖酵解的能量生成得以繼續(xù)。不同來源的乙醇脫氫酶，其編碼序列和活性有所不同。已經(jīng)對(duì)各種來源的乙醇脫氫酶進(jìn)行了測(cè)序和活性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的乙醇脫氫酶的序列和活性有所區(qū)別。其中，如Genebank報(bào)道的，聚球藻的其中一種乙醇脫氫酶ADH B具有如SEQ ID NO本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用光合作用生產(chǎn)乙醇的基因工程藍(lán)藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因?yàn)楸崦擊让富蚝鸵掖济摎涿富颍渲兴霰崦擊让富蚓幋a的丙酮酸脫羧酶具有對(duì)應(yīng)于SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列，以及所述乙醇脫氫酶基因編碼的乙醇脫氫酶具有對(duì)應(yīng)于SEQ?ID?NO.3的氨基酸序列。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：范文俊，鄭曉光，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江齊成碳能科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：