用于檢測(cè)沙眼衣原體的檢驗(yàn)制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種檢測(cè)來(lái)源于沙眼衣原體的遺傳物質(zhì)的方法，該方法包括檢測(cè)特定的核酸序列，所述方法任選地使用特異性引物和探針，并且任選地結(jié)合對(duì)來(lái)源于黑腐堅(jiān)固桿菌的遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，該遺傳物質(zhì)作為內(nèi)對(duì)照；本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還涉及相關(guān)的產(chǎn)品和試劑盒。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及檢驗(yàn)產(chǎn)品、用途和方法，特別是與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)有關(guān)的那些。更具體而言，本專(zhuān)利技術(shù)涉及對(duì)沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)的檢驗(yàn)以及改進(jìn)的PCR對(duì)照。
技術(shù)介紹
沙眼衣原體是專(zhuān)性的人類(lèi)細(xì)胞內(nèi)病原體。衣原體感 染是普遍的性傳播疾病，該細(xì)菌可以在男性和女性中引起多種病狀。臨床癥狀包括尿道炎、直腸炎、沙眼、不孕不育、前列腺炎、附睪炎、子宮頸炎、盆腔炎癥性疾病(PID)以及宮外孕。它還是能夠引起眼睛和肺部感染的新生兒病原體。沙眼衣原體感染是世界范圍最普遍的性傳播疾病之一。據(jù)估計(jì)，美國(guó)有2-3百萬(wàn)個(gè)體感染有衣原體。在英國(guó)，據(jù)估計(jì)，25歲以下的性活躍年輕人中有十分之一感染有衣原體。利用抗生素(例如，諸如強(qiáng)力霉素之類(lèi)的四環(huán)素，或者諸如阿奇霉素之類(lèi)的大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)抗生素)能夠成功地治療沙眼衣原體感染。為了確保及時(shí)地提供恰當(dāng)?shù)闹委煟枰獪?zhǔn)確的診斷沙眼衣原體感染。在諸如英國(guó)等一些國(guó)家，已經(jīng)啟動(dòng)了篩查衣原體的國(guó)家計(jì)劃。沙眼衣原體的感染單位為原體(EB)。EB作為“孢狀”體,其目的是允許衣原體在宿主細(xì)胞外的非支持性環(huán)境下的存活。EB被認(rèn)為是代謝惰性的，直到其粘附到并且被易感宿主細(xì)胞吞噬。可以利用核酸擴(kuò)增的方法來(lái)檢測(cè)沙眼衣原體，例如，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法。PCR有可能擴(kuò)增來(lái)自被感染細(xì)胞以及EB中的核酸。沙眼衣原體在其染色體和質(zhì)粒中均含有遺傳物質(zhì)，每個(gè)EB中染色體以單拷貝存在，質(zhì)粒以6至I O個(gè)拷貝存在。通常，由于質(zhì)粒在每個(gè)EB中為多拷貝，并且由于推測(cè)通過(guò)檢測(cè)基于質(zhì)粒的靶標(biāo)能夠獲得更高的靈敏度，質(zhì)粒被用作核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的優(yōu)選靶標(biāo)。然而，在發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體瑞典變種之后，質(zhì)粒核酸擴(kuò)增試驗(yàn)檢測(cè)體系的適用性已成為問(wèn)題。瑞典變種在質(zhì)粒中包含377個(gè)堿基對(duì)的缺失，因此當(dāng)遇到沙眼衣原體瑞典變種時(shí)，以缺失區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)的檢測(cè)體系將會(huì)提供假陰性結(jié)果。本專(zhuān)利技術(shù)基于實(shí)現(xiàn)這樣的檢驗(yàn)，其檢測(cè)可能更加穩(wěn)定地存在于沙眼衣原體染色體中的序列，因?yàn)槿旧w基因通常突變較少，并且在某種情況下質(zhì)粒可能會(huì)完全丟失。可以預(yù)想以染色體中的基因作為靶標(biāo)是不利的，因?yàn)樵诿總€(gè)細(xì)胞中染色體靶標(biāo)僅以單拷貝的形式存在。然而，本專(zhuān)利技術(shù)的專(zhuān)利技術(shù)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，染色體靶標(biāo)可以提供與質(zhì)粒靶標(biāo)相當(dāng)?shù)臋z測(cè)限(LOD)0核酸擴(kuò)增試駘(NAAT)有大量適合本專(zhuān)利技術(shù)使用的核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(NAAT)法。它們包括公知的PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、重組酶-聚合酶擴(kuò)增(RPA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增(NASBA)、解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。NAAT法很大程度上取代了沙眼衣原體的培養(yǎng)檢測(cè)法，這不僅是因?yàn)榕囵B(yǎng)法需要使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織培養(yǎng)，從而增加了復(fù)雜性。NAAT法以高靈敏度序列特異性的方式，利用酶來(lái)擴(kuò)增一種或多種靶序列，從而進(jìn)行核酸檢測(cè)。關(guān)于NAATs進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，讀者可以參閱以下參考文獻(xiàn)，這里以引用的方式將其內(nèi)容并入本文核酸序列依賴(lài)性擴(kuò)增(NASBA)-Compton J. Nucleic acid sequence-based amplificationNature 1991:350(6313) :91-2轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增 -Wroblewski J.等，Comparison of Transcription MediatedAmplification and PCR Assay Results from Various GenitalSpecimen Types for Detection of Mycoplasma genitalium. J. Clin.Microbiol. 2006:44(9):3306-3312連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-Wiedmann M.等，Ligase chain reaction (LCR)overview and Applications. PCRMethods and Applications 19943 (4) S51-64 環(huán)介導(dǎo)的等溫 DNA 擴(kuò)增-Notomi等,Loop-Mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids.Res. 200023(12) :E63解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增-Vincent M.等，Helicase-dependent isothermal DNA Amplification EMBORep.20045(8)795-800鏈置換擴(kuò)增-Strand displacement amp I i fi cat i on-an isothermal in vitroAmplification technique. Walker 等，Nucleic Acids Res. 1992. 20(7) 1691-1696重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)-DNA Amplification and Detection Made Simple(Relatively). Hoff. M. PublicLibr. Sic. 2006:4(7) :e222 ;以及美國(guó)專(zhuān)利 US7270981。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR是以高敏感度序列特異性的方式，利用熱穩(wěn)定聚合酶并且循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)的溫度條件來(lái)檢測(cè)核酸的方法。最簡(jiǎn)單形式的PCR反應(yīng)經(jīng)過(guò)三個(gè)階段的循環(huán)i)在大約90-100°C的溫度下進(jìn)行的變性階段。在此高溫下，雙鏈DNA變性或“解鏈”以形成單鏈DNA，ii)在50-65°C的典型溫度下進(jìn)行引物退火。此步驟中，正向引物和反向引物與存在于溶液中的任意靶標(biāo)的互補(bǔ)區(qū)域雜交，以及iii)通常在50-80°C下進(jìn)行的延伸階段，在此過(guò)程中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)利用溶液中的三磷酸脫氧核苷酸來(lái)延伸引物的3'端。通常，該循環(huán)進(jìn)行25-45次。根據(jù)某些PCR方案，退火步驟和延伸步驟可以合并，從而使樣品經(jīng)過(guò)90°C至100°C區(qū)間，之后50°C至80°C區(qū)間的兩步程序。理論計(jì)算顯示，30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)可以將單個(gè)靶分子擴(kuò)增268，435，456倍。因?yàn)閿U(kuò)增反應(yīng)的效率低，實(shí)際的擴(kuò)增可能比這少，但盡管如此，PCR反應(yīng)通常仍然可以將單個(gè)或者極少數(shù)的靶分子擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，從而使靶分子更加容易被檢測(cè)。PCR反應(yīng)依賴(lài)于熱穩(wěn)定DNA聚合酶,例如,分離自嗜熱菌屬水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的Taq聚合酶。其它的熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以取代Taq,例如分離自激烈熱火球古菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu聚合酶，其具有Taq聚合酶所沒(méi)有的校對(duì)活性，因此是保真度更高的酶。在大部分分子生物學(xué)教科書(shū)中都能找到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的綜述，參見(jiàn)(例如)以引用方式并入本文的《基因操作原理-基因工程導(dǎo)論》(Old和Primrose著，BlackwellScience公司)。有大量不同的“PCR程式(PCR format)”。作為基本要求，PCR反應(yīng)需要被設(shè)計(jì)為與靶序列的各一側(cè)分別雜交的正向引物和反向引物。擴(kuò)增反應(yīng)針對(duì)兩個(gè)引物之間的插入序列進(jìn)行。可以用非特異的方式來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，所述方式只檢測(cè)雙鏈核酸的存在(例如，使用插入雙鏈DNA的染料，例如溴化乙錠或SYBR-green)。可選的是，可以通過(guò)(例如)在檢測(cè)之前先對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳來(lái)分析產(chǎn)物的近似分子量，從而本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：大衛(wèi)·皮爾斯，馬克·恩賴(lài)特，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：阿特萊斯遺傳學(xué)有限公司，
類(lèi)型：
國(guó)別省市：