本發明專利技術提供了用于降低培養的細胞中乳酸生產和增加多肽生產的方法和組合物。在一個方面，本發明專利技術提供了這樣的方法，所述方法包括培養表達a)乳酸脫氫酶(LDH)特異性的小干擾RNA(siRNA)和b)丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)特異性的siRNA的細胞。在另一個方面，本發明專利技術提供了培養包含LDH特異性的siRNA和PDHK特異性的siRNA的細胞或載體。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術的領域一般地涉及用于在培養細胞中降低乳酸生產和增加多肽生產的方法和組合物。
技術介紹
生物制藥市場迅速增長，截止2010年該產業已飆升至700億美元。參見Genetic Engineering in Livestock New Applications andlnterdisciplinary Perspectives (Engelhard 等人，2009) Springer BerlinHeidelberg。考慮到對治療性蛋白質的需求增加，和公司之間對市場份額的競爭增加，需要改善技術以實現治療性蛋白質的更高生產力。針對這一目標，開發了不同的方法，例如宿主細胞改造。參見Kuystermans等人，Cytotechnology 53(1-3) 3~22 (2007);和 O' Callaghan 和 James, Brief Funct.Genomic Proteomic 7(2) :95-110 (2008)。培養的細胞，如中華倉鼠卵巢(CHO)細胞，廣泛用于生產治療性蛋白質。例如，廣泛使用PH受控的補料-分批式生物反應器培養來生產重組的單克隆抗體。Langheinrich 和 Nienow, Biotechnol. Bioeng. 66 (3) : 171-9 (1999)。乳酸是在補料-分批式培養中積累的主要廢物中的一種，并且表現出抑制細胞生長和蛋白質生產。參見 Glacken 等人，Biotechnol. Bioeng. 32 :491-506 (1988);和 Lao 和 Toth,Biotechnol. Prog. 13 :688-691 (1997)。這反過來導致為了控制pH，需要向培養基中加入的喊的量增加。Dietl 等人，J. Immunol. 184 (3) 1200-9 (2010) ;Langheinrich 和 Nienow,Biotechnol. Bioeng，66 (3) :171-9 (1999)。為了維持pH而增加向細胞培養基中加入的堿可以導致重量摩爾滲透壓濃度增加，并且此增加可以導致細胞生長抑制和減少抗體生產力。Cruz 等人，EnzymeMicrob. Technol. 27 (1-2) :43-52(2000) ; Iran 等人，Biotechnol.Bioeng. 66 =238-246 (1999)。因此，對于開發多肽或更高效價的抗體生產工藝而言，降低乳酸水平是理想的。有許多可以影響細胞培養物中的乳酸生產的因素，例如控制丙酮酸水平。參見Liu等人，J. Biol. Chem. ,284(5) :2811-22(2009);和 Samuvel 等人，J. of Immunol. 182(4)2476-84(2009)。丙酮酸是丙酮酸脫氫酶(I3DH)和乳酸脫氫酶(LDH)的底物。PDH復合體是由三種催化酶E1、E2和E3組成的多酶單位。Patel和Korotchkina，Exp. Mol. Med. 33(4) :191-7(2001)。該復合體催化從丙酮酸轉化為乙酰-CoA的限速轉化反應，該反應是三羧酸(TCA)循環的切入點。PDH的活性受丙酮酸脫氫酶激酶(TOHK)和丙酮酸脫氫酶磷酸酶O3DHP)的調控。I3DHK將PDH磷酸化以抑制它的酶促活性，而I3DHP去磷酸化并因此活化 PDH。參見 Patel 和 Korotchkina，Exp. Mol. Med. 33 (4) :191-7(2001) ;Roche 和Hiromasa, Cell Mol. Life Sci. 64(7-8) :830-49(2007) ;Holness 和 Sugden, BiochemicalSociety Transactions, 31 :1143-1151 (2003)。哺乳動物細胞中有四種具有組織特異性分布的 PDHK 同種型(PDHK1、PDHK2、PDHK3 和 PDHK4)。參見 Harris 等人，Adv. EnzymeRegul. 42 :249-59 (2002);和 Bowker-Kinley 等人，Biochem. J. 329 (I) :191-6 (1998)。LDH直接催化丙酮酸和乳酸的相互轉化，以及與此同時的NADH和NAD+的相互轉化。在哺乳動物細胞中，LDH表現為大部分由LDHa和LDHb基因編碼的A和B亞基(或分別由H和M亞基)組成的同源四聚體或異源四聚體，有時是由LDHc基因編碼的C亞基組成的同源四聚體。參見 Baumgart 等人，J. Biol. Chem. 271 (7) :3846-55 (1996) ;Li 等人，J. Biol. Chem. 258(11) :7029-32(1983) ；Skory C. D. , Appl. Environ. Microbiol. 66 (6)2343-8(2000);和 Read 等人，Proteins 43(2) :175-185 (2001)。例如，在 CHO 細胞中，已經顯示了 LDH同種型為A3B和A2B2四聚體的中間物。Jeong等人，Biochem. Biophys.Res. Commun. 289 (5) :1141-9 (2001)。之前的研究已經顯示，通過同源重組(Chen等人，Biotechnol. Bioeng. 72 (I) :55_61 (2001))、反義技術(Jeong 等人，Biochem. Biophys.·Res. Commun. 289 (5) :1141-9(2001))或小干擾或短干擾 RNA (siRNA) (Kim 和 Lee, Appl.Microbiol. Biotechnol. 74 (I) : 152-9 (2007))破壞基因來下調 CHO 細胞中的 LDHa,可以降低乳酸水平，但未實現蛋白質生產力的可觀改善。例如，在LDHa特異性siRNA的情況下，盡管報道乳酸水平降低45-79%，比生產力(Qp)和產品(抗體)效價沒有顯著的改善，提示在CHO細胞中只敲低LDHa不足以有效改善Qp和產品產量。因此，需要更有效的降低乳酸生產的方法來實現更佳的治療性多肽生產。本文引用的所有出版物、專利和專利申請出于全部目的都通過引用全文整合到本文中，其與具體和分別指明每個出版物、專利和專利申請都通過引用整合的程度相同。 專利技術簡介本專利技術提供了用于在培養細胞中降低乳酸生產和增加多肽生產的方法和組合物。本專利技術人發現在表達多肽(例如，抗體)的培養細胞中，通過siRNA同時下調LDH和TOHK，減少了乳酸水平、乳酸生產速率和重量摩爾滲透壓濃度，并增加了比多肽生產力(例如，比生產力)和多肽生產(例如，生產能力)。此外，這些具有下調的LDH和TOHK的培養細胞沒有表現出對細胞生長、細胞活力和生產的多肽的品質的負面影響。在一個方面，本專利技術提供了在培養細胞中降低乳酸生產的方法，方法包括培養表達a)乳酸脫氫酶(LDH)特異性的小干擾RNA(SiRNA)和b)丙酮酸脫氫酶激酶(I3DHK)特異性的siRNA的細胞。在另一個方面，本專利技術提供了培養的細胞，其包含a) LDH特異性的siRNA和TOHK特異性的siRNA。在一些實施方案中，培養本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：M·周，B·R·斯奈德克爾，C·K·D·恩格，A·沈，
申請(專利權)人：弗·哈夫曼拉羅切有限公司，
類型：
國別省市：
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