用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備和顯微鏡方法技術

本發明專利技術涉及一種用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備和顯微鏡方法。描述了用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備。設備包括兩個成像光學部件，兩個成像光學部件均以聚焦光分布的形式將位于物體空間中的同一個點狀物體成像到兩個單獨的像空間；兩個檢測器單元，兩個檢測器單元中的每個被分配給兩個成像光學部件中的一個，并捕獲在各自的像空間中設置的檢測面的檢測點中可分析的光斑；以及評估單元，評估單元建立兩個檢測面的檢測點之間的相互成對的對應性，并通過分析兩個光斑來確定點狀物體的橫向x-y位置和軸向z位置。

【技術實現步驟摘要】
用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備和顯微鏡方法
本專利技術涉及用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備和顯微鏡方法。
技術介紹
光學顯微成像方法最近已被發展，該光學顯微成像方法使得成像比通過采用單獨標記(特別是熒光分子)的連續的、隨機的定位的常規光學顯微鏡的衍射誘導的分辨率極限更小的樣本結構成為可能。例如在WO2006/127692A2，DE102006021317B3，WO2007/128434A1，U.S.2009/0134342A1，DE102008024568A1，WO2008/091296A2，“Sub-diffraction-limitimagingbystochasticopticalreconstructionmicroscopy(STORM)，”NatureMethods3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“ResolutionofLambda/10influorescencemicroscopyusingfastsinglemoleculephoto-switching，”GeislerC.等，Appl.Phys.A，88，223-226(2007)中描述了這樣的方法。顯微術的這個新的分支也被稱為定位顯微術。應用的方法在文獻中例如通過以下名稱是已知的：(F)PALM((熒光)光活化定位顯微術((fluorescence)photoactivationlocalizationmicroscopy))，PALMIRA(具有獨立地運行采集的PALM(PALMwithindependentlyrunningacquisition))，GSD(IM)(基態損耗(單獨分子返回)顯微術(groundstatedepletion(individualmoleculereturnmicroscopy)))或(F)STORM((熒光)隨機的光學重建顯微術((fluorescence)stochasticopticalreconstructionmicroscopy))。這些新方法的共同之處是：待成像的樣本結構的準備包括使用點狀物體，點狀物體通常被稱為標記，點狀物體具有兩個可分辨的狀態，即“明亮”狀態和“黑暗”狀態。例如，如果熒光染料被用做標記，則該明亮狀態為能夠發熒光的狀態，且該黑暗狀態為不能發熒光的狀態。在優選的特定實施例中，例如，在WO2008/091296A2和WO2006/127692A2中，使用了可光切換的(photoswitchable)或可光激活的(photoactivatable)熒光分子。可選地，如，例如，在德國審查的接受的說明書DE102006021317B3中的，利用標準熒光分子的固有黑暗狀態。為了以比成像光學部件的常規分辨率極限更高的分辨率使樣本結構成像，標記中的小子集被重復地轉換到明亮狀態。這需要選擇形成這個激活的子集的標記的密度，該密度將確保在明亮狀態(因此在該狀態下可通過光學顯微術成像)中相鄰的標記之間的平均距離大于成像光學部件的分辨率極限。形成激活的子集的標記被成像到空間分辨的光檢測器(例如，CCD照相機)上，以便從每個點狀標記記錄以光斑為形式的光分布，通過光學部件的分辨率極限確定光斑的尺寸。因此，在其他激活子集被成像中的每一個中，多數單獨的原始數據圖像被捕獲。在每個單獨的原始數據圖像中，然后可在圖像分析步驟中確定光分布的質心位置，該光分布表示在明亮狀態中的點狀標記。然后將從單獨的原始數據圖像中確定的光分布的質心位置以組合的圖像數據記錄的形式的全部表現而集合。由這個全部表現產生的高度分辨的組合圖像反映標記的分布。典型地復制待成像的樣本結構需要足夠數量的標記信號被檢測。然而，由于在特定激活子集中標記的數量受在明亮狀態中的兩個標記之間的所需的最小平均相互距離限制，因此必須記錄大量的單獨的原始數據圖像以能夠完全地成像該樣本結構。單獨的原始數據圖像的數量范圍典型地為10000至100000。在以上描述的定位顯微術方法中，在光檢測器上生成的單獨的光斑的質心位置典型地僅在二維上確定，以便從所有質心位置重建的樣本結構的高分辨圖像同樣地也僅是二維圖像。然而，在三維上重建該樣本結構是優選的。使在樣本中進行單獨點狀物體的三維位置確定可能的相關領域中的方法是已知的。就這點而言，示例性地參考WO2009/085218A1和U.S.7,772,569B2，以及“Three-dimensionaltrackingoffluorescencenanoparticleswithsubnanometerprecisionbyuseofoff-focusimaging，”OpticsLetters，2003，第28卷(第2期)，MichaelSpeidel等；和“Three-dimensionalParticleTrackingviaBifocalImaging，”NanoLetters，2007，第7卷(第7期)，2043-2045頁，ErdalToprak，等。在U.S.7,772,569B2中描述的方法是基于在不同圖像平面中的至少兩個圖像傳感器上散焦的圖像圖形分析的。在根據WO2009/085218A1的方法中，使用專用的光學部件分析光圖形的橢圓性。相關領域中的方法需要用于質心確定和圖形識別的復雜的圖像分析，或需要限制根據這些方法運行的顯微鏡設備的一般有效性的專用的光學部件。
技術實現思路
因此，本專利技術的目的是提供一種設備和方法，該設備和方法在承擔最小的技術花費的同時將使得點狀物體的簡單三維定位成為可能。本專利技術通過根據權利要求1的顯微鏡設備實現這個目的，因為：兩個成像光學部件的每個包括光學裝置，該光學裝置將各自的聚焦光分布傾斜朝向檢測軸，該檢測軸設在所述各自的成像光學部件中且垂直于各自的檢測器單元的檢測面；通過光學裝置生成所述兩個聚焦光分布的傾斜度是相互相反的，使得考慮檢測點對應性，兩個光斑響應點狀物體在各自的檢測面中的所述z位置的變化在相反的方向上移動；以及評估單元基于兩個光斑的相對位置確定點狀物體的軸向z位置。根據本專利技術，考慮成像光學部件的有限的分辨能力，聚焦光分布可被理解為通過成像(理想化的)點狀物體獲得的三維光分布。在本
中，這樣的聚焦光分布經常以通常稱為點擴散函數(簡稱為PSF)的形式被描述。因此，本專利技術提供：三維聚焦光分布，該三維聚焦光分布由成像光學部件所產生，并通過成像光學部件使點狀物體(例如熒光分子)被成像到兩個檢測器單元上，三維聚焦光分布相對于各自檢測器單元的檢測軸被傾斜地轉變角度，以便獲得(可以說是)對聚焦分布的對稱性的打破，該打破可非常簡單地和容易地用于定位該點狀物體。因此，由于各自聚焦光分布的傾斜度，聚焦光分布沿著各自檢測器單元的檢測軸的偏移導致光斑橫向移動，該光斑由聚焦光分布在對應的檢測器單元上產生。由于兩個聚焦光分布的傾斜度是相互相反的，因此對應的光斑的上述橫向移動在兩個檢測器單元上是相反指向的。因此(除橫向x-y位置之外)，可由光斑的這種相反指向的橫向移動確定點狀物體在物體空間中的軸向z位置。由此，使物體的簡單三維定位成為可能。為了能從在檢測器單元上兩個光斑的以上描述的相反指向的移動推斷點狀物體的三維位置，提供了一個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于點狀物體(14，16)的三維定位的顯微鏡設備(10)，包括：兩個成像光學部件(12，26，26’)，所述兩個成像光學部件(12，26，26’)均以聚焦光分布(40，40’，42，42’)的形式將位于物體空間(18)中的同一個點狀物體(14，16)成像到兩個單獨的像空間；兩個檢測器單元(28，28’)，所述兩個檢測器單元(28，28’)中的每個被分配給所述兩個成像光學部件(12，26，26’)中的一個，并捕獲在所述各自的像空間(34)中設置的檢測面(27，27’)的檢測點中可分析的光斑(54，54’)，所述各自的像空間(34)中設置的檢測面(27，27’)代表通過各自的聚焦光分布(40，40’，42，42’)的平面橫截面；以及評估單元(60)，所述評估單元(60)建立所述兩個檢測面(27，27’)的所述檢測點之間的相互成對的對應性，并通過考慮檢測點對應性分析所述兩個光斑(54，54’)來確定在存在于所述物體空間(18)的物體平面中所述點狀物體(14，16)的橫向x?y位置和在垂直于所述物體平面設置的光軸(O1)的方向上的所述點狀物體(14，16)的軸向z位置，其中，所述兩個成像光學部件(12，26，26’)中的每個包括光學裝置(26，26’)，所述光學裝置(26，26’)將所述各自的聚焦光分布(40，40’，42，42’)傾斜朝向檢測軸(36)，所述檢測軸(36)設在所述各自的成像光學部件(12，26，26’)中且垂直于所述各自的檢測器單元(28，28’)的所述檢測面(27，27’)設置；通過所述光學裝置(26，26’)生成所述兩個聚焦光分布(40，40’，42，42’)的傾斜度是相互相反的，使得考慮所述檢測點對應性，所述兩個光斑(54，54’)響應所述點狀物體(14，16)在所述各自的檢測面(27，27’)中的所述z位置的變化在相反的方向上移動，以及所述評估單元(60)基于所述兩個光斑(54，54’)的相對位置確定所述點狀物體(14，16)的軸向z位置。...

【技術特征摘要】
2011.09.02 DE 102011053232.31.一種用于點狀物體(14，16)的三維定位的顯微鏡設備(10)，包括：兩個成像光學部件，所述兩個成像光學部件均以聚焦光分布(40，40’，42，42’)的形式將位于物體空間(18)中的同一個點狀物體(14，16)成像到兩個單獨的像空間；兩個檢測器單元(28，28’)，所述兩個檢測器單元(28，28’)中的每個被分配給所述兩個成像光學部件中的一個，并捕獲在各自的所述像空間(34)中設置的檢測面(27，27’)的檢測點中可分析的兩個光斑(54，54’)，各自的所述像空間(34)中設置的檢測面(27，27’)代表通過各自的聚焦光分布(40，40’，42，42’)的平面橫截面；以及評估單元(60)，所述評估單元(60)建立所述兩個檢測面(27，27’)的所述檢測點之間的相互成對的對應性，并通過考慮檢測點對應性分析所述兩個光斑(54，54’)來確定在存在于所述物體空間(18)的物體平面中所述點狀物體(14，16)的橫向x-y位置和在垂直于所述物體平面設置的光軸(O1)的方向上的所述點狀物體(14，16)的軸向z位置，其中，所述兩個成像光學部件中的每個包括光學裝置，所述光學裝置將所述各自的聚焦光分布(40，40’，42，42’)傾斜朝向檢測軸(36)，所述檢測軸(36)設在所述各自的成像光學部件中且垂直于所述各自的檢測器單元(28，28’)的所述檢測面(27，27’)設置；通過所述光學裝置生成的所述兩個聚焦光分布(40，40’，42，42’)的傾斜度是相互相反的，使得考慮所述檢測點對應性，所述兩個光斑(54，54’)響應所述點狀物體(14，16)在所述各自的檢測面(27，27’)中的所述z位置的變化在相反的方向上移動，以及所述評估單元(60)基于所述兩個光斑(54，54’)的相對位置確定所述點狀物體(14，16)的軸向z位置。2.如權利要求1所述的顯微鏡設備(10)，其中，所述評估單元(60)獲得所述兩個光斑(54，54’)的質心位置并基于所獲得的所述兩個光斑(54，54’)的質心位置確定所述橫向x-y位置以及所述軸向z位置。3.如權利要求2所述的顯微鏡設備(10)，其中，所述評估單元(60)基于所述兩個光斑(54，54’)的質心位置的平均值確定所述點狀物體(14，16)的所述橫向x-y位置。4.如權利要求2或3所述的顯微鏡設備(10)，其中，所述評估單元基于所述兩個光斑(54，54’)的質心位置之間的距離確定所述點狀物體(14，16)的所述軸向z位置。5.如權利要求1-3中任一項所述的顯微鏡設備(10)，其中，所述兩個檢測器單元(28，28’)的檢測面(27，27’)與物體空間(18)中的相同物體平面光學共軛。6.如權利要求1-3中任一項所述的顯微鏡設備(10)，其特征在于，記錄透鏡(12)，所述記錄透鏡(12)由兩個成像光學部件共用且將從所述點狀物體(14，16)出現的光轉換為平行的光線束(20，22)；以及分束器(50)，所述分束器(50)將由所述記錄透鏡(12)生成的光線束(20，22)分離為兩個部分光線束(52，52’)，所述兩個部分光線束(52，52’)中的每個在各自的檢測面(27，2...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬庫斯·蒂壩，
申請(專利權)人：萊卡微系統CMS有限責任公司，
類型：發明
國別省市：