本發明專利技術涉及一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法，其包括以下步驟：一）黑根霉菌絲脂質體轉化：1）將幼嫩黑根霉濕菌絲與甘露醇水溶液混合后研磨，得菌懸液，備用；2）將脂質體2000與質粒pEGFP-C1混勻，于-5－5℃放置15－60min，然后轉入到菌懸液中，混勻，于-5－5℃放置15－60min；3）將步驟2）所得混合液涂抹PDA平板，25－30℃培養1－5天；二）傳代培養：4）挑取步驟3）經熒光顯微鏡檢測帶有熒光的轉化子接種于PDA平板上25－30℃培養1－5天，共傳代培養5－8次。該方法簡便、快捷、轉化率高、轉化子遺傳穩定，不需要制備原生質體，不需要復雜裝置。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于脂質體轉化
，具體涉及。
技術介紹
目前，絲狀真菌遺傳轉化方法主要有原生質體電轉化法、基因槍轉化法、醋酸鋰介導轉化法、農桿菌介導轉化法、PEG介導的原生質體轉化法和原生質體脂質體轉化法等。這些方法普遍存在操作繁瑣、裝置復雜、轉化率低、轉化子不穩定等缺點。如有些需要制備原生質體，制備過程復雜，包括原生質體電轉化法、PEG介導的原生質體轉化法和原生質體脂質體轉化法。有些方法不需要制備原生質體，但裝置復雜、轉化成本高，如基因槍轉化法。有的僅僅限于少數種類絲狀真菌的轉化，如醋酸鋰介導轉化法。有的轉化率不穩定，轉化效率受多種因素的影響，如農桿菌轉化法轉化效率受農桿菌菌株類型、質粒載體類型及兩者間的匹配情況、培養基成分及誘導條件等多種因素的影響。
技術實現思路
本專利技術目的在于克服現有技術不足，提供， 該方法簡便、快捷、轉化率高、轉化子遺傳穩定，不需要制備原生質體，不需要復雜裝置。為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案，其包括以下步驟一)黑根霉菌絲脂質體轉化1)將幼嫩黑根霉濕菌絲與甘露醇水溶液混合后研磨，得菌懸液，備用；2)將脂質體2000與質粒pEGFP-Cl混勻，于_5— 5°C放置15 — 60min，然后轉入到菌懸液中，混勻，于_5 — 5°C放置15 — 60min ；3)將步驟2)所得混合液涂抹PDA平板，25- 30°C培養I 一 5天；二)傳代培養4)挑取步驟3)經熒光顯微鏡檢測帶有熒光的轉化子接種于PDA平板上25- 30°C培養I 一 5天，共傳代培養5 — 8次。較好的，所述步驟I)具體為取O. 05 - O. 2g幼嫩黑根霉濕菌絲與O. 5 — 2ml、濃度O. 5 — I. Omol/1的甘露醇水溶液混合。所述步驟2)具體為取30 - 100 μ I脂質體2000與30 — 100 μ I質粒pEGFP-Cl 混勻。和現有技術相比，本專利技術所述的黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法具有簡便、快捷， 轉化率高，轉化子遺傳穩定，且不需要制備原生質體，不需要復雜裝置等優點。用綠色熒光蛋白基因作為選擇標記，可直接進行活體觀察，不需添加其他抗生素等選擇性藥物，并且可簡便地用于監測轉化子中選擇標記基因的消除。附圖說明圖I為黑根霉脂質體轉化GFP基因熒光檢測(放大倍數10X20)；圖2為黑根霉轉化子總DNA電泳圖；G1、G2、G3、G4、G5、G6為轉化后六代黑根霉孢子傳代菌絲DNA，M為hind- III，總基因組大約為20kbp ；圖3為黑根霉轉化子總DNA中PCR檢測GFP基因電泳圖；G1、G2、G3、G4、G5、G6為轉化后六代黑根霉孢子傳代菌絲總基因組PCR擴增GFP基因電泳圖，M為Ikb plus ；圖4為黑根霉轉化子southern雜交結果；CK為未轉化黑根霉菌絲基因組，G1、G2、G3、 G4、G5、G6為轉化后六代黑根霉孢子傳代菌絲基因組經過Sac I單酶切后southern雜交圖。具體實施方式以下通過實施例對本專利技術作進一步的說明，但本專利技術的保護范圍并不局限于此。實施例I 一、實驗材料I.菌種和質粒匍枝根霉(黑根霉)Rhizopus stolonifer黑根霉(Rhizopus stolonifer)購自中國科學院微生物研究所中國普通微生物保藏管理中心，編號是3. 4098。質粒pEGFP-Cl由鄭州大學細胞生物學實驗室饋贈。2.培養基PDA培養基(1L):馬鈴薯200g (去皮切塊加水煮沸15分鐘用四層紗布過濾取濾液)，瓊脂(Agar) 20g，葡萄糖20g，水補足1000ml，分裝后高壓蒸汽滅菌。3.脂質體脂質體 2000 (Lipofectamine 2000), Invitrogen, Carlsbad, California, USA。二、實驗方法，其包括以下步驟一)黑根霉菌絲脂質體轉化1)取O.Ig幼嫩黑根霉濕菌絲于滅過菌的研缽中，加入1ml、濃度O. 6mol/l的甘露醇水溶液，混合后研磨，得菌懸液，轉移至I. 5ml離心管中，備用；2)取50μ I脂質體2000與50 μ I質粒pEGFP-Cl混勻，于(TC放置30min，然后轉入到菌懸液中，混勻，于0°C放置30min，得混合液；3)取100μ I步驟2)所得混合液涂抹PDA平板(共涂抹10個平板)，28°C培養2天；二)傳代培養4)挑取步驟3)經熒光顯微鏡檢測帶有熒光的轉化子接種于PDA平板上28°C培養3天， 共傳代培養6次。對轉化子的PCR檢測(1)引物設計根據PEGFP-Cl中目的基因EGFP序列設計的特異性引物GFP-S atggtgagcaagggcgaggagc GFP-X ttatctagatccggtggatccc(2)利用CTAB法提取黑根霉轉化子總DNA(3)目的基因(即熒光蛋白基因一GFP基因)的PCR擴增以轉化傳代后的黑根霉基因組為模板，PCR反應體系如下，總體積25微升DNA μ dNTP mixture4M-1上游引物 GFP-S (25mM)O. 5μ1下游引物 GFP-X (25mM)O. 5μ110XLA PCR Buffer (Mg2+Plus)2. 5μ1TaLaRa LA Taq (5u/ul)0. 5M-1ddH2016μ1PCR擴增程序如下:94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火40s，72。。延伸lmin,30 個循環；72°C延伸IOmin。PCR反應結束后，取5P1PCR反應液用I. 0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(結果見圖2 和3)。雜交檢測(I)PCR產物的回收純化1)將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因，具體操作步驟參照如下2)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量(提前記錄I. 5 ml離心管重量),該重量作為一個凝膠體積(如100 mg = 100 μ I體積)3)加入3個凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75° C加熱，間斷混合(每2_3 min),直至凝膠塊完全熔化(約6-8 min)。4)加O. 5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B,混合均勻；當分離的DNA片段小于400bp時，加入I個凝膠體積的異丙醇。5)吸取3中的混合液，轉移到DNA制備管(置于2 ml離心管)中，12000g離心I min。棄濾液。6)將制備管置回離心管，加O. 5 ml Buffer ffl, 12000g離心30 s,棄濾液。7)將制備管置回離心管，加O. 7 ml Buffer W2,12000g離心30 s，棄濾液，以同樣的方法再用O. 7 ml Buffer W2洗漆一次12000g離心I min。8)將制備管置于2 ml離心管中，12000g離心I min。9)將制備管置于潔凈的I. 5 ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25_30 μ I水或Eluent,室溫靜置I min。12000g離心I min洗脫DNA。10)取適量電泳檢測回收效率。(2) Southern 雜交檢測使用高效DNA地高辛標記和檢測試劑盒I (DIG-high prime DNA labeling and detection Start本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法，其特征在于，包括以下步驟：一）黑根霉菌絲脂質體轉化：1）將幼嫩黑根霉濕菌絲與甘露醇水溶液混合后研磨，得菌懸液，備用；2）將脂質體2000與質粒pEGFP?C1混勻，于?5－5℃放置15－60min，然后轉入到菌懸液中，混勻，于?5－5℃放置15－60min；3）將步驟2）所得混合液涂抹PDA平板，25－30℃培養1－5天；二）傳代培養：4）挑取步驟3）經檢測帶有熒光的轉化子接種于PDA平板上25－30℃培養1－5天，共傳代培養5－8次。
【技術特征摘要】
1.一種黑根霉菌絲脂質體直接轉化方法，其特征在于，包括以下步驟 一)黑根霉菌絲脂質體轉化 1)將幼嫩黑根霉濕菌絲與甘露醇水溶液混合后研磨，得菌懸液，備用； 2)將脂質體2000與質粒pEGFP-Cl混勻，于_5— 5°C放置15 — 60min，然后轉入到菌懸液中，混勻，于_5 — 5°C放置15 — 60min ； 3)將步驟2)所得混合液涂抹PDA平板，25- 30°C培養I 一 5天； 二)傳代培養 4)挑取步驟3)經檢測帶有熒光的轉化子接種...
【專利技術屬性】
技術研發人員：邱立友，孫強，崔繼紅，柴冉，高玉千，戚元成，申進文，
申請(專利權)人：河南農業大學，
類型：發明
國別省市：
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