本發明專利技術依據畢赤酵母表達系統密碼子的偏嗜性，選擇高表達密碼子重新設計合成新的豬β干擾素成熟肽核苷酸序列。成功地構建了重組酵母表達質粒pPICZαC-IFN-β，不僅在畢赤酵母中對豬β干擾素實現了正確表達，而且使豬β干擾素在畢赤酵母菌中表達更容易，表達量更高，為基因工程大規模生產發酵奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及編碼豬β干擾素的基因片段及其應用。
技術介紹
近年來豬病毒性傳染病日益泛濫，已嚴重地威脅著我國畜牧業的持續發展。免疫抑制病及病毒抗原快迅變異，常導致疫苗免疫失敗；加之不斷出現新的病毒病，目前還尚無 成功的疫苗接種預防。另ー方面，疫苗對疾病只有預防作用，治療還有賴于抗生素的使用。而ー些抗藥性菌株的出現，給人類食品和健康帶來極大的威脅，ー些國家已明令禁止在養殖生產中應用某些抗生素和抗菌劑。因此，生產中迫切需要ー種既有效又有利于環保的新方法來防控畜禽疾病。實踐證明，干擾素作為ー種廣譜的抗病毒劑，在病毒性傳染病的防控方面具有廣闊的應用前景。傳統的生產方法由中草藥等誘生劑誘導產生干擾素，因純化工藝復雜，產量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研的應用。隨著豬干擾素基因的克隆成功，對其重組產物的臨床應用及作用機理的研究也隨之展開。1990年，Lefevre和LaBonnar等人在大腸桿菌中表達了 PoIFN-α I基因，得到了ー個含189個氨基酸的前體蛋白，去除其N端的含23個氨基酸的信號肽后，得到了具有完全天然PoIFN-α I生物學活性的產物，并且其在豬源性細胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激豬白細胞產生的干擾素的6倍。Pol JM等(1991)研究發現rPoIFN-a I能夠抑制偽狂犬病毒(PRV)強毒和中等毒力病毒在豬鼻腔黏膜組織stroma細胞層的増殖，PRV接種干擾素處理的豬成纖維細胞和豬腎細胞，病毒滴度明顯下降。Horisberger MA (1992)比較了重組PoIFN-α (rPoIFN-a )和重組PoIFN-Y (rPoIFN-Y )在豬的細胞中抗病毒活性的區別，發現rPoIFN- a可大大降低豬水泡性ロ炎病毒(VSV)在豬PK-15上引起的病變，井能削弱豬水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒在豬腎細胞中的復制，但rPoIFN-a和rPoIFN-γ對門戈病毒(一種腦心肌炎病毒)都有抗病毒作用。Jordan LT等(1994)發現rPoIFN-α對傳染性胃腸炎病毒(TGEV)有很好的預防作用。Tonomura N等(1996)研究發現HuIFN-α處理Vero后PRV的增殖受到抑制，PRV的立即早期基因的mRNA在干擾素處理的Vero中降低，瞬時表達試驗表明PRV IE啟動子的轉錄被選擇性抑制。BuddaertW (1998)對rPoIFN-α在體內、外對豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)的抗病毒活性進行了研究，發現PRRSV在體內、外對rPoIFN-α都很敏感，rPoIFN-α可明顯抑制PRRSV的產量和感染細胞的數量。chinsangaram J.等(2001)人用大腸桿菌表達rPoIFN-α或rPolFN-β并分別進行了抗ロ蹄疫病毒(FMDV)實驗，發現rPoIFN-α和rPoIFN-β抑制FMDV復制是在蛋白質翻譯水平上的，主要是激活雙鏈RNA依賴性蛋白激酶(PKR)作用的結果在細胞中加入PKR抑制劑2_氨基嘌呤后,病毒的產量就會上升；而RNase L和PKR基因缺失的細胞在干擾素的作用下仍能感染FMDV，這充分說明了 PKR在抑制病毒復制中起作用。我國學者也對豬α干擾素進行了多項研究。曹瑞兵等(2004)克隆了一種新的豬IFN-α基因并在大腸桿菌中進行了其成熟蛋白的單純表達，表達產物具有較高的抗病毒活性。杜以軍等利用豬IFN-α的成熟蛋白基因構建了重組腺病毒質粒pAd-PoIFN-a轉染HEK-293A細胞，滴度為107TCID5(l/mL。RT-PCR證明目的基因在mRNA水平上可有效表達；在PK-15細胞上可以檢測到較強的抗豬口蹄疫病毒活性，從而為研究豬口蹄疫免疫防治新技術奠定了重要基礎。謝海燕等(2004)克隆了豬IFN-a基因，構建了原核表達載體，初步對其進行了原核表達研究；我國學者夏春等(2005)報道了用pQE30表達載體在大腸桿菌原核表達的rPoIFN-α在豬源細胞和非豬源細胞系上可顯著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖，證 明了原核表達PoIFN-a的可行性及將基因工程原核表達的PoIFN-α真正用于生產實踐中作為抗病毒制劑可行性。曹瑞兵等對豬IFN-a I基因進行了改造，在保留編碼蛋白序列的同時，使用了大腸埃希菌的偏愛密碼子，將合成的豬IFN-a I成熟蛋白編碼基因插入原核單純表達載體PRLC中，實現了豬IFN-a I在大腸埃希菌中的高效表達，且重組豬IFN-a I具有較高的抗病毒活性，約為6.4X106U/mg。此外，葛麗等(2005)克隆了豬IFN-α基因，構建了真核表達載體，初步對其做了畢赤酵母分泌表達研究。劉占通等對丹系長白和法系長白、英系大白和法系大白豬IFN-a基因進行克隆，得到了上述4個品系的豬IFN-a基因，證明核苷酸同源性均在97. 2%以上，氨基酸同源性均在92. 8%以上。在豬β干擾素基因研究方面，2000年夏春等首次對豬干擾素β基因進行分子克隆與測序，克隆片段長668個核苷酸，編碼186個氨基酸。其中，76 636位含有I個0RF，蛋白分子量為21.8KU。除此之外，溫納相(2005)和彭貴青(2005)也對豬干擾素β的基因進行了分子克隆與測序，并檢測其生物活性。在表達方面，曹瑞兵(2004)和吳陽(2006)分別對豬β干擾素的基因進行了原核表達，表達量分別為17. 3%和18%，表達產物均為融合蛋白。其中曹瑞兵用重組豬β干擾素處理豬腎傳代細胞ΡΚ-15后，細胞病變抑制法(CPE5tl)測定結果表明，重組豬β干擾素可顯著抑制豬流行性腹 寫病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的感染。而后，為了研制高活性的重組豬β干擾素，曹瑞兵(2006)對豬干擾素β進行畢赤酵母偏嗜性改造并構建了酵母表達質粒PPICZ α A-PIB, pPICZ a A-PIB電轉化導入畢赤酵母菌株Χ_33后經甲醇誘導發酵高產量分泌表達豬IFN-β，其中BI株酵母的IFN-β產量最高，約為2. 5X IO5U/mL,其表達量約為60 μ g/mL,比活為4. 17 X 106U/mg。將發酵上清液用PEG20000濃縮后進行SDS-PAGE和Western-blot檢測，結果表明表達產物是分子量約為28Ku和25Ku蛋白的混合物，兩者均可與豬IFN-β陽性抗血清發生特異反應。表達產物比豬IFN-β理論推導分子量(約20.8KU)大，推測可能是表達產物發生了不同程度的糖基化。重組豬IFN-β對偽狂犬病毒在細胞中増殖可呈現抑制作用，并且豬IFN-β對偽狂犬病毒在牛腎細胞(MadenDarbyBovine Kidney cells, MDBK)上早期增埴的抑制效果最為明顯。在豬Y干擾素基因研究方面，IFN-Y雖然只有ー種基因，但其結構更為復雜，如編碼人和鼠IFN-Y的基因長約6Kb，各包含有4個外顯子和3個內含子。IFN-Y與I型干擾素(IFN-α與IFN-β)田在基因和蛋白質水平上沒有明顯的相關性(DeGrado，etal，1991)。雖然IFN-Y具有其它干擾素大多數的生物學活性，但在特異性抗病毒活性方面比IFN-α和IFN-β要低10-100倍，而在免疫調節活性方面要高100-1000本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種編碼豬β干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ?IDNO.4所示的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種編碼豬β干擾素的基因片段，其特征在于，具有如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。2.如權利要求I所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的上游引物Ρβi具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；下游引物P β2具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列。3.如權利要求2所述的基因片段，其特征在于，用于擴增其序列的PCR方法的退火溫度為 52。。。4.權利要求f3所述的基因片段在構建可表達豬β干...
【專利技術屬性】
技術研發人員：羅滿林，陳瑞愛，劉健，張欣，唐明森，
申請(專利權)人：華南農業大學，廣東大華農動物保健品股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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