一類具有改善阿爾茲海默病作用的β1-腎上腺素受體激動(dòng)劑制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一類具有β1-腎上腺素受體激動(dòng)活性的化學(xué)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，有很強(qiáng)的體外激動(dòng)β1-腎上腺素受體的活性，EC50均為nM水平，其中活性最強(qiáng)的化合物的EC50為24.34±0.94，可以作為神經(jīng)保護(hù)劑，用于治療阿爾茨海默病。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一類具有β I-腎上腺素受體激動(dòng)劑活性的化合物，該類化合物作為βI腎上腺素受體激動(dòng)劑具有很好的治療阿爾茨海默病的活性。
技術(shù)介紹
阿爾茨海默癥(Alzheimer' s disease,AD)亦稱老年性癡呆癥或早老性癡呆癥，是老年期常見的一類慢性、進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞退行性病變。隨著人口的老齡化，AD已成為僅次于心血管病、腫瘤和中風(fēng)而居第四位的死因。有關(guān)AD的病因以及發(fā)病機(jī)理至今尚不明確，目前尚無特效治療藥物。AD的病理標(biāo)志是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,A0 )在胞外沉積形成老年斑以及NFT-tau磷酸化，同時(shí)，神經(jīng)炎癥已經(jīng)成為引發(fā)AD的第三個(gè)關(guān)鍵病理標(biāo)志，在AD進(jìn)程中，神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與AD早期的發(fā)病機(jī)制。腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥進(jìn)程主要由小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)，激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放大量的前體炎癥因子，造成腦內(nèi)鄰近細(xì)胞炎癥及死亡，加劇β_淀粉樣蛋白的沉積，從而引發(fā)神經(jīng)元功能障礙，導(dǎo)致神經(jīng)變性的發(fā)生。β I-腎上腺素受體(β -adrenoceptor, β I-AR)是經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，其生物學(xué)效應(yīng)主要由經(jīng)典的Gs-cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)。β I-AR激活后通過Gs蛋白調(diào)節(jié)能夠激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，激活蛋白激酶A(PKA)及其調(diào)控的蛋白質(zhì)磷酸化，在調(diào)控交感神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)去甲腎上腺素神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面起關(guān)鍵性作用。β I-AR與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的突出可塑性(synapticplasticity)有關(guān)，β 1-AR的激活可引起海馬體和杏仁核的長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long-termpotentiation，LTP)，增強(qiáng)動(dòng)物的記憶組織。國外研究表明，內(nèi)源性去甲腎上腺素(NA)可使促炎癥因子IL-I β、IL-6和腫瘤壞死因子TNF-α等水平下降，還可對(duì)抗體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸引起的興奮性毒性，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用；同時(shí)，β I-AR激動(dòng)劑還可劑量依賴性的增加皮質(zhì)紋狀體富集的酪氨酸磷酸酶(STEP)翻譯水平，這種酶可以增強(qiáng)認(rèn)知、改善學(xué)習(xí)記憶。這些研究提示腦內(nèi)了 β I-AR的代謝和調(diào)節(jié)可能與AD發(fā)病、預(yù)防和治療有一定關(guān)系，但目前臨床上尚無此類藥物出現(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種治療阿爾茨海默病的化合物，該化合物是β I-腎上腺素受體激動(dòng)劑，對(duì)阿爾茨海默病有預(yù)防或者治療作用。本專利技術(shù)所述的化合物包括含治療有效量的化學(xué)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本專利技術(shù)采用高通量篩選技術(shù)，建立了 β I-腎上腺素受體激動(dòng)劑高通量篩選模型并應(yīng)用于化合物大規(guī)模篩選，通過篩選一批從CHEMDIV公司購買的化合物并進(jìn)行功能性驗(yàn)證尋找到了具有化學(xué)式(I)的β -腎上腺素受體激動(dòng)劑，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的AD藥效學(xué)和機(jī)制研究。本專利技術(shù)的技術(shù)方案為在中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞(CHO)內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β I腎上腺素受體，建立β I腎上腺素受體激動(dòng)劑高通量篩選模型，進(jìn)行初篩，復(fù)篩，構(gòu)效關(guān)系分析，得到一類具有抗阿爾茲海默病的候選藥物。具體步驟如下步驟一建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β I腎上腺素受體的CHO細(xì)胞株。步驟二 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定及最佳細(xì)胞數(shù)確定。步驟三陽性藥驗(yàn)證。步驟四采用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和摸索的最佳檢測條件對(duì)化合物進(jìn)行β I腎上腺素受體激動(dòng)劑的高通量篩選，得到有明顯量效關(guān)系的化合物。附圖說明圖I :標(biāo)準(zhǔn)曲線及最佳細(xì)胞數(shù)曲線圖2 :陽性藥扎莫特羅(XamoteiOl)量效關(guān)系曲線圖3 :化合物1-6的EC50圖4 :化合物 7-12 的 EC50具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖說明本專利技術(shù)的具體實(shí)施例方式I.建立及培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β I腎上腺素受體的CHO-β I細(xì)胞株。應(yīng)用重組酶介導(dǎo)的盒交換技術(shù)(Recombinase-MediatedCassette Exchange,RMCE)批量構(gòu)建G蛋白偶聯(lián)受體細(xì)胞株，并使其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染β I腎上腺素受體，培養(yǎng)CHO-β I細(xì)胞使其達(dá)到穩(wěn)定生長狀態(tài)。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定及最佳細(xì)胞數(shù)確定。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的正確性以及能篩選出可靠的β I腎上腺素受體激動(dòng)劑，在建立模型時(shí)需要測定標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定最佳細(xì)胞數(shù)。待CHO-β I細(xì)胞生長到80%的時(shí)用O. 5mMEDTA的PBS消化細(xì)胞，離心去除上層液體，最后將細(xì)胞用刺激緩沖液重懸用于確定最佳細(xì)胞數(shù)。使用PerkinElmer公司的LANCE cAMP 384Kit試劑盒，配制標(biāo)準(zhǔn)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)梯度稀釋液及腺苷酸環(huán)化酶激活劑(forskolin)梯度稀釋液。標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法^fcAMP的標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μ mol/L (LANCE cAMP檢測試劑盒自帶)，用刺激緩沖液逐級(jí)稀釋為終濃度4倍的工作濃度，cAMP與抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個(gè)小時(shí)后檢測；最佳細(xì)胞數(shù)檢測方法將50mM的forskolin母液用刺激緩沖液逐級(jí)稀釋為終濃度4倍的工作濃度，forskolin與含有細(xì)胞的抗體溶液各5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液，孵育一個(gè)小時(shí)后在EnVision微孔板測讀儀上檢測。根據(jù)forskolin量效曲線窗口(性噪比S/B)及曲線與cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相近的細(xì)胞濃度作為最佳細(xì)胞數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線及最佳細(xì)胞數(shù)確定見圖I。3.選用β I腎上腺素受體激動(dòng)劑的陽性藥Xamoterol對(duì)所建立的β I腎上腺素活性篩選模型進(jìn)行驗(yàn)證并且根據(jù)量效曲線計(jì)算其的EC5Q。陽性藥測定方法將IOOmM的Xamoterol母液，用刺激緩沖逐級(jí)稀釋為終濃度2倍的工作濃度，陽性藥Xamoterol 5 μ I與含有最佳細(xì)胞數(shù)的抗體溶液5 μ I加入384孔板中共同孵育45分鐘，加入10 μ I終止液再孵育一個(gè)小時(shí)后用EnVision微孔板測讀儀檢測，陽性藥量效曲線見圖2。4.在上述的最佳檢測條件下進(jìn)行β I腎上腺素受體激動(dòng)劑的的初篩和復(fù)篩。初篩與復(fù)篩過程相同，初篩只選用一個(gè)濃度對(duì)8萬個(gè)化合物進(jìn)行初步篩選，再選擇初篩有效的化合物梯度稀釋8個(gè)濃度進(jìn)行復(fù)篩，過程如下用Janus全自動(dòng)加樣工作站稀釋化合物并吸取5 μ I轉(zhuǎn)移到384孔板中，再用Multidrop自動(dòng)加樣儀將含有最佳細(xì)胞數(shù)的抗體溶液5 μ I加入384孔板中，兩者共同孵育45分鐘后，Multidrop自動(dòng)加樣儀將10 μ I終止液加入384孔板中，再次孵育一個(gè)小時(shí)，用EnVision微孔板測讀儀檢測。復(fù)篩得到一系列具有Dl受體激動(dòng)作用的化合物。處理數(shù)據(jù)，計(jì)算化合物EC5tl，各個(gè)化合物的EC5tl見圖3，圖 4。復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選得到的化合物可以根據(jù)母核的結(jié)構(gòu)總結(jié)為一類，結(jié)構(gòu)式與EC5tl如下本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
下述化合物(I)或其藥學(xué)上可以接受的鹽：其中：R1代表氫原子或甲基；R2代表氫原子或甲基；R3代表氫原子、酯、酸、酰胺基，其中酰胺上的氨基可以是伯胺或叔胺；R4代表氫原子、氟原子、溴原子、甲基或甲氧基。FSA00000823809200011.tif

【技術(shù)特征摘要】
1.下述化合物(I)或其藥學(xué)上可以接受的鹽2.權(quán)利要求I要求保護(hù)的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可以接受的鹽作為P...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張陸勇，何玲，嚴(yán)明，蘇冉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國藥科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：