陽離子脂質體及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種陽離子脂質體，包括陽離子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖或甘露寡糖；所述陽離子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子組成球殼狀的磷脂雙分子層；所述甘露糖或甘露寡糖連接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂。這種陽離子脂質體通過添加甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂，抗原呈遞細胞靶向性和在淋巴結中的富集得到提高，具有免疫促進作用，可以提高脂質體疫苗的免疫效力。本發明專利技術還提供一種上述陽離子脂質體的制備方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫治療領域，尤其涉及一種。
技術介紹
疫苗是預防和控制傳染性疾病發生發展的重要手段。免疫佐劑(又稱非特異性免疫增生劑)則是疫苗中不可或缺的組成成分，能夠有效地促進疫苗誘導的特異性免疫反應。隨著疫苗研究的飛速發展，新型的基因工程疫苗正逐步取代傳統的減毒活疫苗和滅活疫苗。與傳統的疫苗相比，基因工程疫苗具有純度高、特異性強、安全性好等優點，然而由于其免疫原性普遍較差，迫切需要結合有效的免疫佐劑，從而提高疫苗的免疫效力。 脂質體納米顆粒是由磷脂雙層殼包裹水相核心形成的球形的實體，其結構類似生物膜，是一種生物相容性好且無毒的納米材料。它可包封水溶性和脂溶性藥物，具有減少藥物劑量、緩釋、及靶向性釋放藥物等優點，因而被廣泛用于納米抗腫瘤藥物的開發。此外，納米脂質體也是一種優良的抗原載體，不僅能夠包裹一系列理化性質不同的抗原及免疫佐齊U，保護蛋白多肽抗原不被降解，還可以促進抗原呈遞細胞對抗原的吞噬及呈遞，提高機體的特異性免疫反應。基于以上這些優點，脂質體納米顆粒作為一種新型的疫苗載體，正逐漸用于細菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生蟲疫苗以及抗腫瘤疫苗等研制開發。中性脂質體和表面攜帶正電荷的陽離子脂質體是最常用的納米疫苗載體。其中特別值得關注的是陽離子脂質體，它不但是優良的蛋白/多肽抗原載體，還是一種新型的免疫佐劑，可直接活化抗原呈遞細胞，增強疫苗誘導的免疫反應。目前，陽離子脂質體已被GSK公司用于新一代流感疫苗。以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為代表的抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APCs)在免疫反應中占據核心地位。其主要作用是識別、攝取和呈遞抗原，繼而引發淋巴細胞活化和特異性體液及細胞免疫應答。APCs表面廣泛表達C型凝集素類受體，如甘露糖受體(mannose receptor, MR)、DEC205/gp200-MR6等。這些受體直接參與了抗原呈遞細胞對抗原的識別、攝取和呈遞過程。在抗原和疫苗表面修飾C型凝集素類受體的特異性配體，如甘露糖和甘露聚糖，可促進抗原呈遞細胞對抗原的攝取，增強疫苗的免疫效力。Copland (Copland. M. J. , Baird, M. A. , Rade s, T.,McKenzie, J. L. , Becker, B. , Reck, F. , Tyler, P. C. and Davies, N. M. (2003)Liposomaldelivery of antigen to human dendritic cells. Vaccine 21,883-90.)等在中性脂質體中摻入末端修飾有甘露三糖的二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(tr imannose-dipalmi toy Iphosphatidylethanolamine, man3_DPPE),從而使脂質體表面攜帶甘露糖殘基。結果表明man3-DPPE修飾的脂質體不但提高DC對抗原的攝取，而且顯著增強DC誘導的T淋巴細胞增殖。Kojima 等(Kojima, N. , Biao, L. , Nakayama, T. , Ishii, M, Ikehara, Y. and Tsujimura,K. (2008)Oligomannose-coated liposomes as a therapeutic antigen-delivery and anadjuvant vehicle for induction of in vivo tumor immunity. J Control Release 129,26-32.)則發現，man3-DPPE修飾可促進脂質體腫瘤疫苗在外周淋巴結內的集聚，并顯著增強疫苗誘導的抗腫瘤免疫。目前的研究主要通過化學鍵合的方法將甘露糖或寡甘露糖直接修飾到脂質體的磷脂分子上，使得脂質體表面攜帶甘露糖分子，從而提高其抗原呈遞細胞靶向性。然而，事實上由于顆粒大小、電荷、及表面性質等理化因素的影響，脂質體疫苗在注射入體內后絕大部分滯留于注射位點，不能有效地進入淋巴器官，降低了脂質體疫苗的免疫效力。
技術實現思路
基于此，有必要提供一種能夠提高脂質體疫苗免疫效力的。—種陽離子脂質體，包括陽離子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖或甘露寡糖；所述陽離子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子組成球殼狀的磷脂雙分子層；所述甘露糖或甘露寡糖連接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂。優選的，所述陽離子脂與所述中性磷脂的摩爾比為I : 19 99 : I。 優選的，所述甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂的摩爾數與所述陽離子脂和所述中性磷脂摩爾數之和的比值范圍為I : 5 I : 50。優選的，所述聚乙二醇衍生化磷脂中聚乙二醇的分子量為350 2000。優選的，所述甘露糖或甘露寡糖通過醛基-氨基或羥基-氨基縮合的方式連接在所述聚乙二醇衍生化磷脂上。優選的，所述陽離子脂為一種表面攜帶正電荷的兩性分子，所述陽離子脂的主鏈是甘油，甘油的三個羥基中中間的羥基連接帶正電荷的季銨鹽，另外兩個羥基被飽和或不飽和脂肪酸酯化。優選的，所述陽離子脂為雙十烷基二甲基溴化銨、二油酰三甲基銨丙烷、二油酰丙基氯化三甲銨、二甲氨基乙基氨甲酰基-膽固醇和二油酰磷脂酰膽堿醚中的至少一種。優選的，所述中性磷脂為一種兩性分子，所述中性磷脂的表面靜電荷基本接近0，所述中性磷脂的主鏈是甘油，甘油的三個羥基中側端的一個羥基被磷酸酯化，另外兩個羥基被飽和或不飽和脂肪酸酯化，磷酸基團又與一個極性的膽堿基團或膽胺基團相連。優選的，所述中性磷脂為二油酰磷脂酰膽堿、二豆蘧酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷酸乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的至少一種。優選的，所述甘露糖為能被甘露糖受體識別的單糖，包括D-甘露糖、甘露糖苷、L-巖藻糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-乙酰半乳糖胺和D-鼠李糖。優選的，所述甘露寡糖由2 10個能被甘露糖受體識別的單糖通過a 1-2鍵、a 1-3鍵、a 1-4鍵、a 1-6鍵或0 1-4鍵任意組合形成；所述能被甘露糖受體識別的單糖包括D-甘露糖、L-巖藻糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-乙酰半乳糖胺和D-鼠李糖。一種陽離子脂質體的制備方法，包括如下步驟步驟一、提供聚乙二醇衍生化磷脂，將甘露糖或甘露糖苷連接在聚乙二醇衍生化磷脂上，得到甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂；步驟二、將陽離子脂、中性磷脂和所述甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂分別溶解于氯仿和甲醇混合溶劑中，混合后得到混合液；步驟三、用穩定的氮氣流或惰性氣體流將所述混合液旋轉吹干，使之形成一層均勻的薄膜，真空干燥后加入PBS緩沖液并放置4°C水化，然后超聲并擠壓過膜兩次得到所述陽離子脂質體。這種陽離子脂質體通過添加甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂，提高了抗原呈遞細胞靶向性和在淋巴結中的富集，具有免疫促進作用，可以提高脂質體疫苗的免疫效力。附圖說明圖I為一實施方式的包覆有抗原的陽離子脂質體的結構示意圖。圖2為小鼠樹突狀細胞在體外對LP、LP-P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種陽離子脂質體，其特征在于，包括陽離子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖或甘露寡糖；所述陽離子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子組成球殼狀的磷脂雙分子層；所述甘露糖或甘露寡糖連接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂。

【技術特征摘要】
1.一種陽離子脂質體，其特征在于，包括陽離子脂、中性磷脂、聚乙二醇衍生化磷脂以及甘露糖或甘露寡糖；所述陽離子脂、所述中性磷脂以及所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂分子組成球殼狀的磷脂雙分子層；所述甘露糖或甘露寡糖連接在所述聚乙二醇衍生化磷脂的一端形成甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂。2.如權利要求I所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述陽離子脂與所述中性磷脂的摩爾比為I : 19 99 I。3.如權利要求I所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述甘露糖或甘露寡糖修飾的聚乙二醇衍生化磷脂的摩爾數與所述陽離子脂和所述中性磷脂摩爾數之和的比值范圍為I : 5 I : 50。4.如權利要求I所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述聚乙二醇衍生化磷脂中聚乙二醇的分子量為350 2000。5.如權利要求I所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述甘露糖或甘露寡糖通過醛基-氨基或羥基-氨基縮合的方式連接在所述聚乙二醇衍生化磷脂上。6.如權利要求I所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述陽離子脂為一種表面攜帶正電荷的兩性分子，所述陽離子脂的主鏈是甘油，甘油的三個羥基中中間的羥基連接帶正電荷的季銨鹽，另外兩個羥基被飽和或不飽和脂肪酸酯化。7.如權利要求I或6所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述陽離子脂為雙十烷基二甲基溴化銨、二油酰三甲基銨丙烷、二油酰丙基氯化三甲銨、二甲氨基乙基氨甲酰基-膽固醇和二油酰磷脂酰膽堿醚中的至少一種。8.如權利要求I所述的陽離子脂質體，其特征在于，所述中性磷脂為一種兩性分子，所述中性磷脂的表面靜電荷基本接近0，所述中性磷脂的主鏈是甘油，甘油的三...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬軼凡，莊燕，蔡林濤，
申請(專利權)人：中國科學院深圳先進技術研究院，
類型：發明
國別省市：