一種簡化的可對放流中國對蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法技術(shù)

一種可對放流中國對蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，包括以下步驟：每年放流季節(jié)，海捕野生交尾雌蝦，并進(jìn)行眼柄標(biāo)記，然后進(jìn)行苗種培育。生產(chǎn)完成的雌蝦-75℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫磺锛荆诟鞣帕麂в吸c(diǎn)進(jìn)行放流個體的捕撈取樣，樣品回捕后通過兩組中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)檢測放流個體及數(shù)量，最終確定中國對蝦的放流效果；本發(fā)明專利技術(shù)僅需對生產(chǎn)放流苗種的中國對蝦母本進(jìn)行樣本采集，并利用兩組熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR對采集的放流樣本進(jìn)行親子溯源分析，即可實(shí)現(xiàn)對放流中國對蝦的跟蹤識別。避免了現(xiàn)有技術(shù)需要大批量制備中國對蝦全同胞家系、越冬中國對蝦親體培育、雄蝦親本識別的繁瑣操作。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于海水動物放流領(lǐng)域，具體地涉及一種簡便易操作地可實(shí)現(xiàn)對放流中國對蝦個體精確追溯的放流方法。
技術(shù)介紹
中國對奸(Fenneropenaeus chinensis)是我國特有的一年生大型經(jīng)濟(jì)奸類,主要分布在黃渤海沿岸海區(qū)，經(jīng)濟(jì)效益顯著。二十世紀(jì)八十年代以來，由于捕撈強(qiáng)度的不斷加大、生態(tài)變遷、水域污染、病害頻發(fā)以及人工養(yǎng)殖業(yè)對野生中國對蝦的盲目需求等綜合因素的影響，中國對蝦野生資源量急劇萎縮。為保護(hù)、恢復(fù)中國對蝦種群和漁業(yè)資源，我國于 1984年開始在特定海區(qū)進(jìn)行中國對蝦移殖/增殖放流，每年放流約30億尾仔蝦。經(jīng)過連續(xù)多年的大規(guī)模種苗放流，中國對蝦資源量得到了一定的恢復(fù)。不過由于無法準(zhǔn)確區(qū)分回捕群體中放流個體和野生個體及數(shù)量，因而無法科學(xué)評估放流群體對野生資源的補(bǔ)充水平， 分析野生資源的動態(tài)變化并制定科學(xué)的放流規(guī)劃，這是中國對蝦放流迫切需要解決的重大問題。衡量和評估放流效果的重要指標(biāo)之一是放流回捕率估算，這是制定科學(xué)的放流規(guī)劃、 有效促進(jìn)野生中國對蝦種群資源恢復(fù)的重要指標(biāo)。但是現(xiàn)有的檢測方法由于存在各種缺陷而無法提供精確的回捕率，主要存在以下幾個原因1)回捕樣品中無法準(zhǔn)確區(qū)分放流和野生對蝦個體；2)放流個體的物理標(biāo)記過程操作繁瑣、無法大規(guī)模進(jìn)行，一般只對部分放流個體進(jìn)行標(biāo)記；3)物理標(biāo)記對個體規(guī)格要求苛刻、標(biāo)記后個體死亡率大，影響回捕率準(zhǔn)確估算。因此，目前迫切需要一種技術(shù)對放流群體進(jìn)行大批量標(biāo)志，以此為中國對蝦放流提供精確的回捕率數(shù)據(jù)。并且該技術(shù)應(yīng)該具備以下特征1)放流個體攜帶特有的標(biāo)識系統(tǒng)，該系統(tǒng)可精確區(qū)分野生和人工放流個體；2)攜帶該標(biāo)識系統(tǒng)的個體可以大批量培育并維系個體一生，不會對標(biāo)識個體具有任何內(nèi)在或物理傷害；3)該標(biāo)識個體可被迅速鑒別并與其它個體區(qū)分開來；4)標(biāo)識個體放流不會破壞或影響野生中國對蝦群體資源結(jié)構(gòu)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一種可對放流中國對蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，精確評估中國對蝦放流效果，精確評估放流回捕率，推算野生群體資源量的目的，制定科學(xué)的放流規(guī)劃、有效促進(jìn)野生中國對蝦種群資源恢復(fù)。本專利技術(shù)所采用的放流效果評估方法符合放流檢測所要具備的5個條件1)具有確定遺傳背景、不攜帶特定病原的中國對蝦大規(guī)模多家系苗種培育；2)中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體/家系高效精確識別；3)攜帶特定DNA分子指紋圖譜放流個體的標(biāo)志放流；4)攜帶特定DNA分子指紋圖譜放流個體的大規(guī)模檢出；5)放流和野生資源及回捕率的精確計(jì)算。本專利技術(shù)是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種可對放流中國對蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，包括以下步驟每年放流季節(jié)，海捕野生交尾雌蝦，并眼柄標(biāo)記，然后進(jìn)行苗種培育，產(chǎn)卵后的雌蝦-75°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫磺锛荆诟鞣帕麂в吸c(diǎn)進(jìn)行放流個體的捕撈取樣，樣品回捕后通過兩組中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)檢測回捕樣本，并確定放流個體的數(shù)量，最終評估中國對蝦的放流效果； 其中所述的中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)，第一組微衛(wèi)星四重 PCR引物組合及序列如下-6-FAM-CCTTGACACGGCATTGATTGG-3-VIC-TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3-NED-CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3-PET-GCACATATAAGCACAAACGCTC-3反向序列為反向序列為反向序列為反向序列為EN0033正向序列為5 '5' -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3'RS0622正向序列為5 '5' -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3'FCKR002正向序列為5 5' -AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3'FCKRO13正向序列為5 5' -CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3'；進(jìn)一步，所述的第一組四重PCR引物的反應(yīng)體系為25μ I反應(yīng)體系，其中包括 2. 5μ 110XPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物的濃度均為10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為 O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13 正反引物每條各為 O. 5μ1 ； IOOng 基因組 DNA、250ymol/LdNTPs 2. 5 μ 1,2. Ommo I/L Mg2+2. O μ I、I 單位 Taq DNA 聚合酶；進(jìn)一步，所述的第一組四重PCR引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :94°C變性40s，70°C退火Imin (每個循環(huán)退火溫度降低1°C)，72°C延伸lmin，共循環(huán)5 次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)8次；再進(jìn)行循環(huán)3 :94°C變性40s,64°C退火Imin (每個循環(huán)退火溫度降低1°C),72°C延伸lmin,共循環(huán)4 次；進(jìn)行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸 5min，4°C保存并結(jié)束程序。其中所述的中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)，第二組微衛(wèi)星四重 PCR引物組合及序列如下RSllOl 正向序列為5 ‘-6-FAM—CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 ‘，反向序列為5’ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘FCKR005正向序列為 5’ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3FCKR007正向序列為 5， -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3FCKR009正向序列為 5’ -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-35(-Vic—CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 (-NED—CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 (-PET—GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為進(jìn)一步，所述的第二組四重PCR引物的反應(yīng)體系為25μ I反應(yīng)體系，其中包括2.5μ 110XPCR緩沖液、四種熒光標(biāo)記引物的濃度均為10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為 O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13 正反引物每條各為 O. 5μ1 ； IOOng 基因組 DNA、250ymol/LdNTPs 2. 5 μ 1,2. Ommo I/L Mg2+2. O μ I、I 單位 Taq DNA 聚合酶；進(jìn)一步，所述的第二組四重PCR引物的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C變性4min后進(jìn)行循環(huán)I :94°C變性40s，52°C退火lmin，72min延伸lmin，共循環(huán)10次；隨后進(jìn)行循環(huán)2 -MV 變性40 s，51°C退火Imin(每個循環(huán)退火溫度降低O. 5°C)，72°C延伸Imin，共循環(huán)4次；再進(jìn)行循環(huán)3 :94°C變性40 s，49°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)10次；最后72°C延伸 5min，4°C保存并結(jié)束程序。進(jìn)一步，放流效果的確定是按如下公式計(jì)算的放流回捕率=放流個體數(shù)量/樣品總數(shù)。本專利技術(shù)進(jìn)行個本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種可對放流中國對蝦實(shí)現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特征在于包括以下步驟：每年放流季節(jié)，海捕野生交尾雌蝦，并眼柄標(biāo)記，然后進(jìn)行苗種培育，生產(chǎn)完成的雌蝦?75℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫磺锛荆诟鞣帕麂в吸c(diǎn)進(jìn)行放流個體的捕撈取樣，樣品回捕后通過兩組中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)檢測放流個體及數(shù)量，最終確定中國對蝦的放流效果；所述的兩組中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)，第一組微衛(wèi)星四重PCR引物組合及序列如下：EN0033正向序列為：5′?6?FAM?CCTTGACACGGCATTGATTGG?3′，反向序列為：5′?TACGTTGTGCAAACGCCA?AGC?3′；RS0622正向序列為：5′?VIC?TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG?3′，反向序列為：5′?CACATGCCTTTGTGTGAAAACG?3′；FCKR002正向序列為：5′?NED?CTCAACCCTCACCTCAGGAACA?3′，反向序列為：5′?AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC?3′；FCKR013正向序列為：5′?PET?GCACATATAAGCACAAACGCTC?3′，反向序列為：5′?CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT?3′；所述的兩組中國對蝦熒光標(biāo)記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術(shù)，第二組微衛(wèi)星四重PCR引物組合及序列如下：RS1101正向序列為：5′?6?FAM?CGAGTGGCAGCGAGTCCT?3′，反向序列為：5′?TATTCCCACGCTCTTGTC?3′FCKR005正向序列為:5′?VIC?CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT?3′，反向序列為：5′?TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT?3′FCKR007正向序列為:5′?NED?CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA?3′，反向序列為：5′?CAACATAAGACTCACGAGACAG?3′FCKR009正向序列為:5′?PET?GCACGAAAACACATTAGTAGGA?3′，反向序列為：5′?ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC?3′。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王偉繼，張凱，孔杰，金顯仕，阮曉紅，
申請(專利權(quán))人：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：