(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法技術

一種(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其以(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子和氫供體的存在下發生還原反應生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯，所述的生物催化劑為重組酮還原酶，所述的輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氫供體為異丙醇，所述的還原反應在pH為6.0~9.0的水相緩沖液中進行。本發明專利技術方法通過采用重組的酮還原酶，避免了因添加輔助的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖而導致的使酶失活和產品提取困難等問題；并且采用改進的工藝，使得反應條件溫和，反應效率提高，操作簡便。

【技術實現步驟摘要】

：本專利技術屬于生物制藥和綠色化學領域，具體涉及一種(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法。
技術介紹
：利用生物酶催化劑制備手性藥物中間體，在醫藥工業中有著重要的應用。在生產世界上暢銷的降膽固醇他汀類藥物，即羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑類化合物的研究中，其手性側鏈的生產步驟是最關鍵的。其中，在嘗試制備關鍵中間體(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的研究中，利用還原酶從(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯一步還原得到目標產物，以其高效率、高選擇性的特點成為化學和制藥工業界重點研究的對象。在已經公開的制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法中，化學還原方法的反應條件往往需要低溫(如-70℃)，及易燃的硼烷類化合物參與，是極為危險和難以實用化的(Angew.?Chem.?Int.?Ed.?2000,?39:?4306-4307)。相比較而言，生物法的應用條件更加溫和，因此也更加實用和環保。例如美國專利US2008/0248539?A1公開了一種利用來自于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的酮還原酶及其突變株還原法生產(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法。為了實現輔酶的原位循環，該專利采用了添加輔助的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖的方法。該方法雖然較化學法有諸多優勢，但是其輔酶循環體系會產生與產物等當量的葡萄糖酸，為了維持反應體系的pH，需要加入等當量的堿進行中和，不但影響反應的工藝經濟性和原子經濟性，反應體系中產生的酸和添加的堿還可能對酶的活力產生一定的影響，并非該路線的最佳選擇。本專利公開了一種改進的利用酮還原酶生產(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，不僅避免了化學法中存在的種種問題，還對生物法進行了合理的改進，具有重要的工業應用價值。
技術實現思路
：本專利技術的目的在于提供一種改進的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法。為解決以上技術問題，本專利技術采用如下技術方案：一種(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其以(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子和氫供體的存在下發生還原反應生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯，所述的生物催化劑為重組酮還原酶，所述的重組酮還原酶的制備方法為：將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡納霉素抗性的液體LB培養基中，于35~40℃下搖床活化8~12小時，將活化后得到的培養物接種到含卡納霉素抗性的液體LB培養基中，于35~40℃下搖床擴大培養，培養至OD600值達到0.6~0.8時，加入誘導劑，于25~33℃下繼續培養8~12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8~12分鐘，再離心，將上清液預凍至溫度降至-10~-25℃，然后再凍干24~48小時，即得凍干粉狀的重組酮還原酶，所述的重組酮還原酶能將異丙醇轉化為丙酮，所述的輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氫供體為異丙醇，所述的還原反應在pH為6.0~9.0的水相緩沖液中進行。在反應起始時的反應體系中，重組酮還原酶與(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯的質量百分比為2~4%，輔因子與(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯的質量百分比為0.05~0.2%，所述的異丙醇相對所述的(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯的物質的量百分比為100~150%。所述的誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖。所述的輔因子為NAD/NADH?。所述的水相緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖溶液或三乙醇胺鹽酸緩沖溶液。所述的還原反應在pH為8.0的水相緩沖液中進行。所述的制備方法的實施過程如下：在反應容器中依次加入底物(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯，異丙醇，所述的水相緩沖液，攪拌均勻，繼續加入重組酮還原酶和輔因子，在25~45℃下，攪拌反應，利用HPLC-MS檢測反應進程，待轉化率達90~99%時，加入乙酸乙酯進行多次萃取，合并有機相并蒸發脫去溶劑，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯產品。根據本專利技術，除重組酮還原酶，其余原料均可由通用渠道商購獲得。本專利技術的有益效果在于:本專利技術方法通過采用重組的酮還原酶，避免了因添加輔助的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖而導致的使酶失活和產品提取困難等問題；并且采用改進的工藝，使得反應條件溫和，反應效率提高，操作簡便。附圖說明：附圖1為轉化率隨pH變化圖。具體實施方式：本專利技術的反應式如下：下面的實施例可以使本專業的技術人員更全面地理解本專利技術，但不以任何方式限制本專利技術。實施例一：重組酮還原酶酶粉搖瓶生產工藝將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落從甘油管或轉化平板接種到4?mL含卡納抗性的液體LB培養基活化過夜（37℃，200?rpm）。從過夜培養物以1/100接種量轉接100?mL含卡納抗性的液體LB培養基，37℃、200?rpm振蕩培養至OD600值達到0.6-0.8，加入IPTG?0.5?mM于30℃繼續培養過夜。離心收集細胞，用10?mL磷酸鹽緩沖液（2?mM，pH?7.0）懸浮細胞。細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10分鐘。離心，上清液預凍過夜。凍干48h后得到重組酮還原酶粉。實施例二：輔因子再生體系驗證取重組酮還原酶酶粉1?mg，加入1?mL?磷酸鹽緩沖溶液(pH?7.0，50?mM)，異丙醇0.01?mL，NAD?15?mg，于5?mL離心管中，30℃水浴恒溫磁力攪拌1?min，加入1?mL乙酸丁酯萃取，氣相色譜分析。檢測結果表明有丙酮生成，異丙醇被轉化，根據峰面積計算轉化率為10.5%。實施例三：反應監測方法采用HPLC-MS檢測方法測定(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯到(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的轉化。樣品處理：取不同時間點反應液50?μL，加入甲醇950?μL，混勻后用0.45?μm微孔濾膜過濾，然后進樣檢測（進樣量?1?μL）。色譜條件為：色譜柱??SB-C18?2.1×50?mm，3.5?μm，流動相?A?水（0.1%HCOOH）-B?乙腈，流速?0.3?mL/min，0-5?min?32%B。質譜條件?干燥氣流速?12?L/min，鞘氣壓力?40?PSI，干燥氣溫度350℃，毛細管電壓3500?V，檢測模式為正離子模式。檢測離子?181.1,?183.1,?185.1,?203.1,?205.1,?237.1,?239.1，(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯保留時間3.8?min,?(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯保留時間2.6?min。實施例四：pH條件優化取重組酮還原酶酶粉10?mg，加入10?mL?磷酸鹽緩沖溶液(100?mM，pH分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種(3R,5S)？6？氯？3,5？二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其以(S)？6？氯？5？羰基？3？羥基己酸叔丁酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子和氫供體的存在下發生還原反應生成(3R,5S)？6？氯？3,5？二羥基己酸叔丁酯，其特征在于：所述的生物催化劑為重組酮還原酶，所述的重組酮還原酶的制備方法為：將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡納霉素抗性的液體LB培養基中，于35~40℃下搖床活化8~12小時，將活化后得到的培養物接種到含卡納霉素抗性的液體LB培養基中，于35~40℃下搖床擴大培養，培養至OD600值達到0.6~0.8時，加入誘導劑，于25~33℃下繼續培養8~12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8~12分鐘，再離心，將上清液預凍至溫度降至？10~？25℃，然后再凍干24~48小時，即得凍干粉狀的重組酮還原酶，所述的重組酮還原酶能將異丙醇轉化為丙酮，所述的輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氫供體為異丙醇，所述的還原反應在pH為6.0~9.0的水相緩沖液中進行。

【技術特征摘要】
1.?一種(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其以(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯為底物，該底物在生物催化劑、輔因子和氫供體的存在下發生還原反應生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯，其特征在于：所述的生物催化劑為重組酮還原酶，所述的重組酮還原酶的制備方法為：將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡納霉素抗性的液體LB培養基中，于35~40℃下搖床活化8~12小時，將活化后得到的培養物接種到含卡納霉素抗性的液體LB培養基中，于35~40℃下搖床擴大培養，培養至OD600值達到0.6~0.8時，加入誘導劑，于25~33℃下繼續培養8~12小時，離心，收集沉淀物，加入磷酸鹽緩沖液得懸浮液，將懸浮液置于冰水浴中超聲破碎8~12分鐘，再離心，將上清液預凍至溫度降至-10~-25℃，然后再凍干24~48小時，即得凍干粉狀的重組酮還原酶，所述的重組酮還原酶能將異丙醇轉化為丙酮，所述的輔因子為NAD/NADH或NADP/NADPH，所述的氫供體為異丙醇，所述的還原反應在pH為6.0~9.0的水相緩沖液中進行。
2.?根據權利要求1所述的(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物制備方法，其特征在于：在反應起始時的反應體系中，重組酮還原酶與(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯的質量百分比為2~4%，輔因子與(S)-6-氯-5-羰基-3-羥基己酸叔丁酯的質量百分比為...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鞠鑫，樊博，
申請(專利權)人：蘇州漢酶生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：