本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種1,2,4-丁三醇的生物合成方法。該方法包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇功能的酶系統(tǒng)。所述酶系統(tǒng)包括如下：（a1）具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶；（a2）具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶；（a3）具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2,4-二羥基丁酸功能的酶；（a4）具有將所述2,4-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2,4-二羥基丁酰輔酶A功能的酶；（a5）具有將所述2,4-二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇功能的酶。本發(fā)明專利技術(shù)對建立擁有自主產(chǎn)權(quán)的、原料價格低廉的、合成途徑全新的、轉(zhuǎn)化效率較高的1,2,4-丁三醇的生物合成方法具有重要意義。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及種1,2,4-丁三醇的生物合成方法，特別涉及一種利用重組大腸桿菌將蘋果酸及其鹽形式轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇的方法。?
技術(shù)介紹
為了滿足人類生產(chǎn)和生活方式不斷進(jìn)步的各種需求，越來越多的重要化學(xué)品受到了研究者的廣泛關(guān)注。其中，1，2,4-丁三醇是一種在軍工和民用上都具有重要用途的化學(xué)品。它是手性多羥基醇，主要用于合成高能材料1，2,4-丁三醇三硝酸酯，后者可用作飛機、火箭、導(dǎo)彈等軍事武器的推進(jìn)劑，較傳統(tǒng)的硝化甘油具有沖擊敏感性更低、熱穩(wěn)定性更好、揮發(fā)性更小和加工安全性更高四大優(yōu)點，是硝化甘油理想、安全的替代品。硝化甘油目前在美國雙基推進(jìn)劑中的用量超過130萬噸/年，若全部被1,2,4-丁三醇三硝酸酯替代，則1，2,4-丁三醇在美國軍用方面的潛在市場需求量至少為170萬噸/年，按照目前1,2,4-丁三醇12-19萬元/噸的價格估算，其僅在美國軍用市場上的市值就至少達(dá)2,000-3,000億元/年。此外，1，2,4-丁三醇還可用于制備生物活性劑、醫(yī)藥用緩釋劑、卷煙添加劑、抗菌劑、彩色顯影劑等。?目前1，2,4-丁三醇主要以石油化工產(chǎn)品為原料，依靠化學(xué)法在高溫高壓下催化生產(chǎn)。其商業(yè)化的生產(chǎn)方式是，將蘋果酸二甲酯在NaBH4和C2-C6醇的中進(jìn)行還原反應(yīng)，得率為0.48g/g。其存在的主要弊端有：原料成本高、反應(yīng)能耗大、生產(chǎn)危險性大、副產(chǎn)物多、環(huán)境污染嚴(yán)重等。在當(dāng)今各種全球問題的巨大壓力下，人們更傾向于利用廉價的、可再生的生物質(zhì)資源為原料，通過簡單高效、對環(huán)境友好的生物發(fā)酵過程來生產(chǎn)1,2,4-丁三醇。但是，由于自然界不存在1,2,4-丁三醇的天然生物合成途徑，所以生物法生產(chǎn)1,2,4-丁三醇的研究進(jìn)展比較緩慢。迄今為止，僅一位美國學(xué)者在政府的大力支持下，先是利用木糖或阿拉伯糖原料，建立了1,2，4-丁三醇的生物合成途徑（Niu,W.,Molefe,M.N.,Frost，J.W.?Microbial?synthesis?ofthe?energeticmaterial?precursor1，2,4-butanetriol.Joumal?ofthe?American?Chemical?Society.2003,125(43):12998-12999.），之后經(jīng)過不斷優(yōu)化，提高了木糖途徑的1,2,4-丁三醇產(chǎn)量，達(dá)到35g/L木糖的生產(chǎn)水平（J·W·佛羅斯特，W·牛，D-1，2,4-丁三醇的微生物合成，中國專利申請?zhí)枺?00780032753.9，申請日：2007年7月19日；JohnW.Frost，GreenSyntheisofD-1，2，4ButantetroilfromD-Glucose.2009Annual?Report，GrantNo.N000140710323）。繼而再改造戊糖磷酸途徑，以期利用葡萄糖而非木糖為原料，降低原料成本。截至目前，已通過兩步法的生產(chǎn)方式，實現(xiàn)了以葡萄糖為原料的1,2,4-丁三醇的生物合成（John?W.?Frost，Green?Syntheis?ofD-1,2,4ButantetroilfromD-Glucose.2009Annual?Report，GrantNo.N000140710323）：第一步，利用大腸桿菌WY9/pWY1實現(xiàn)了從葡萄糖到木質(zhì)酸的生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)量為5.5g/L木質(zhì)酸；第二步，利用大腸桿菌DH5α/pWN6.186A實現(xiàn)了從木質(zhì)酸到1，2,4-丁三醇的生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量均未報道。而將該兩步合在起，將葡萄糖直接轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇的一步法生產(chǎn)則未取得成功。究其原因，可能是由于葡萄糖本身在大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中，進(jìn)入戊糖磷酸途徑的效率并不是很高所致。而葡萄糖經(jīng)糖酵解進(jìn)入TCA循環(huán)的效率則相對較高。?綜上所述，如果能為將來建立一套擁有自主產(chǎn)權(quán)的、原料價格低廉的、合成途徑全新的、轉(zhuǎn)化效率較高的1，2，4-丁三醇的生物合成方法，將具有重要意義。目前尚未有以蘋果酸或其鹽類形式為原料生物合成1,2,4-丁三醇的相關(guān)報道。?
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種1，2,4-丁三醇的生物合成方法。?本專利技術(shù)所提供的制備1,2,4-丁三醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇的?步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2,4-丁三醇功能的酶系統(tǒng)。?在上述方法中，所述將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1，2，4-丁三醇，具體包括如下步驟：?（1）將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A；（2）將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛；（3）將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁酸；（4）將所述2，4-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁酰輔酶A；（5）將所述2，4-二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁醛；（6）將所述2,4-二羥基丁醛轉(zhuǎn)化為1,2，4-丁三醇。?在上述方法中，所述酶系統(tǒng)具體包括如下（a1）-（a5）：?（a1）具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶1；（a2）具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶2；（a3）具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁酸功能的酶3；（a4）具有將所述2,4-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2，4-二羥基丁酰輔酶A功能的酶4；（a5）具有將所述2，4-二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇功能的酶5。?具體的，所述酶1為琥珀酰輔酶A合成酶、蘋果酸硫激酶中的至少一種；所述酶2為琥珀酸半醛脫氫酶；所述酶3為4-羥基丁酸脫氫酶；所述酶4為4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶A:苯乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶中的至少一種；所述酶5為雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶。?在本專利技術(shù)的一個實施例中，所述酶系統(tǒng)具體由如下酶1-酶5組成：?所述酶1為百脈根根瘤菌(Mesorhizobium?loti）MAFF303099的琥珀酰輔酶A合成酶；所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述琥珀酰輔酶A合成酶的α亞基的氨基酸序列如序列表中序列2所示；?所述酶2為牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas?gingivalis）W83的琥珀酸半醛脫氫酶；所述琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示；?所述酶3為牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas?gingivalis）W83的4-羥基丁酸脫氫酶；；所述4-羥基丁酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示；?所述酶4為牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas?gingivalis）W83的4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶；所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如序列表中序列5所示；?所述酶5為丙酮丁醇梭菌（Clostridium?acetobutylicum）DSM1731的雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶；所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列6所示。?序列1由394個氨基酸組成；序列2由299個氨基酸組成；序列3由451個氨基酸組成；序列4由371個氨基酸組成；序列5由431個氨基酸組成；序列6由858個氨基酸組成。?在上述方法中，所述重組生物細(xì)胞是將如上所述酶本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種制備1,2,4？丁三醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4？丁三醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4？丁三醇功能的酶系統(tǒng)。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種制備1,2,4-丁三醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為
1,2,4-丁三醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇
功能的酶系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶系統(tǒng)包括如下（a1）-（a5）：
（a1）具有將蘋果酸或其鹽轉(zhuǎn)化為蘋果酰輔酶A功能的酶1；
（a2）具有將所述蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為蘋果酸半醛功能的酶2；
（a3）具有將所述蘋果酸半醛轉(zhuǎn)化為2,4-二羥基丁酸功能的酶3；
（a4）具有將所述2,4-二羥基丁酸轉(zhuǎn)化為2,4-二羥基丁酰輔酶A功能的酶4；
（a5）具有將所述2,4-二羥基丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇功能的酶5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶1為琥珀酰輔酶A合成酶
和蘋果酸硫激酶中的至少一種；
所述酶2為琥珀酸半醛脫氫酶；
所述酶3為4-羥基丁酸脫氫酶；
所述酶4為4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、肉桂酰輔酶A:苯乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶中的
至少一種；
所述酶5為雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述酶1為琥珀酰輔酶A合成酶，
所述琥珀酰輔酶A合成酶的β亞基的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述琥珀酰
輔酶A合成酶的α亞基的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述酶2為琥珀酸半醛脫氫酶；所述琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如序列表中
序列3所示；
所述酶3為4-羥基丁酸脫氫酶；所述4-羥基丁酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表中
序列4所示；
所述酶4為4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶；所述4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的氨基酸
序列如序列表中序列5所示；
所述酶5為雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶；所述雙功能乙醛輔酶A/醇脫氫酶的氨基
酸序列如序列表中序列6所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述重組生物細(xì)胞是將如
下編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞后得到的表...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡真，李興華，張延平，李寅，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院微生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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