末端連接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種末端連接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和應用，該發明專利技術應用于醫藥領域。此聚合物活性酯在水中水解半衰期為10.9分鐘，具有理想的與生物活性物質的氨基反應的活性。其結構式如下：R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；R1可以是CH3－，也可以是R2R2的結構如下：R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亞胺基。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及聚乙二醇水溶性聚合物及其制備方法和應用，尤其涉及聚乙二醇活性酯及其制備方法和應用。
技術介紹
使用化學方法將水溶性聚合物聚乙二醇（Polyethylene?Glycol，PEG）結合到分子和表面在生物技術中具有重大的應用意義。PEG在生物
有著廣泛的應用：一些PEG的活性衍生物結合到蛋白質、酶的分子上，即對酶進行修飾，由于PEG可以溶于有機溶劑，PEG結合到酶分子可以使PEG與酶的結合物溶于有機溶劑；與未修飾的蛋白質相比，將PEG連接到蛋白質上可減小蛋白的免疫原性、降低腎臟排除速率，并可從中促使結合物在血液循環中的半衰期的增加；PEG結合到表面可減小蛋白質和細胞的吸附并改變表面的帶電性質，PEG結合到脂質體上可以使其半衰期有極大增加，并能夠增加其作為藥物緩釋的介質的能力。PEG只有經過活化才能夠結合到分子或表面上。因此，一系列的活化衍生物被制備出來。目前應用較廣的修飾劑活化類型為羧酸的活化酯類。該類修飾劑是通過活化酯對蛋白的自由氨基進行酰化，從而將PEG鏈結合到蛋白質分子上實現修飾的。目前，許多用于修飾的活化的羧基PEG具有較差的反應活性。例如，羧甲基化PEG（CM-PEG）的NHS酯的反應活性太強，以至溶解在水中立刻水解（在pH8、25°C下的水解半衰期為0.75?min），這種高反應活性是羧甲基化PEG活性酯的嚴重缺陷。而第一代修飾劑中活化的SC-PEG雖然有較好的反應活性（在pH8、25°C下的半衰期為20.4?min），但由于在分子內含有不穩定的酯鍵，現已較少使用。又如丁二酸酐丁二酰亞胺酯活化的PEG（succinimidyl?succinate，SS-PEG）。SS-PEG的制備是通過mPEG與丁二酸酐發生酯化反應，使丁二酸酐開環，從而在PEG的鏈端造成一個羧基，然后又將羧基活化成丁二酰亞胺酯。該試劑在與蛋白質結合后還存在一個酯鍵，而酯鍵由于其固有的不穩定性在PEG高分子結合到蛋白質上時非常容易被水解。這種水解不僅會使PEG鏈從蛋白上脫落，喪失PEG修飾帶來的益處，而且留在蛋白質上的丁二酸尾部還可作為半抗原導致蛋白質的免疫原性。Harris等人在mPEG的末端引入丙酸單位，使得這種丙酸PEG活性酯的水解半衰期增加到16.5分鐘，但該方法涉及了在PEG一端引入氰基，需要再進行強酸和強堿的水解才能得到產物，極有可能破壞PEG主鏈。目前，許多用于修飾的活化的羧基PEG具有很差的反應活性：不是反應太快就是反應太慢。例如，羧甲基化PEG（CM-PEG）的NHS酯的反應活性太強，以至溶解在水中立刻水解，這種高反應活性是羧甲基化PEG活性酯的嚴重缺陷。
技術實現思路
本專利技術需要解決的技術問題是公開一種末端連接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和應用，以克服現有技術存在的缺陷，滿足醫藥領域和生物工程領域發展的需要。本專利技術的末端連接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯的結構式如下：R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；R1可以是CH3－，也可以是R2R2的結構如下：R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亞胺基。本專利技術提供的連接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯具有合適的反應活性，活性酯在水中的水解半衰期為10.9分鐘，且不含有其它的酯鍵連接。本專利技術的連接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯的制備方法包括如下步驟：（1）CM-PEG（羧甲基化聚乙二醇）的制備：將聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇鉀回流反應1~2小時，加入溴乙酸乙酯回流反應2~4小時，然后室溫反應18~24小時，濃縮后用乙醚沉淀，沉淀物堿水解然后酸化，采用常規的方法收集產物；（2）脯氨酸乙酯鹽酸鹽的制備：將氯化氫氣體通入含有脯氨酸的乙醇直到飽和，然后收集脯氨酸乙酯鹽酸鹽；（3）末端連接脯氨酸的聚乙二醇酸衍生物的制備：取步驟（1）中制備的CM-PEG溶于二氯甲烷，然后依次加入二環己基碳二亞胺、脯氨酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的pH值調節到8~9，反應8~12小時，過濾，濾液加入乙醚，收集沉淀產物，將產物干燥后溶于水，加入氫氧化鈉溶液調節pH至10~12，反應1~3小時，然后用草酸將溶液pH調節到2~4，收集產物，獲得末端連接脯氨酸的聚乙二醇酸衍生物。（4）取步驟（3）的產物溶于二氯甲烷，加入1.5~3倍摩爾量的二環己基碳二亞胺和1.5~3倍摩爾量的N-羥基丁二酰亞胺，10~30℃攪拌反應20~28小時，收集產物，獲得末端連接脯氨酸的聚乙二醇活性酯。所說的脯氨酸為D型、L型或外消旋體；聚乙二醇優選的分子量為2000~30000?Da。本專利技術的末端連接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯，在水中擁有10.9分鐘的水解半衰期，具有理想的與生物活性物質氨基的反應活性，可用于與生物活性物質相連接，制備PEG修飾的生物活性物質，用于制備緩釋藥物的介質等。本專利技術還涉及一種所說的末端連接脯氨酸的聚乙二醇活性酸或酯與生物活性物質的結合物，結構通式如下：其中：n為1或2，NH-Pro部分代表生物活性物質的氨基位點。生物活性物質選自蛋白質、酶、多肽、藥物、染料、核苷、酯類或脂質體。采用上述方法制備的末端連接脯氨酸的聚乙二醇活性酯，具有良好的反應活性，可用于與蛋白質或酶的分子相連接，以及用于制備緩釋藥物的介質。具體實施方式實施例1與分子量為5000?Da的單甲氧基PEG以酰胺鍵連接的脯氨酸活性酯的合成步驟1：CM-PEG（羧甲基化聚乙二醇）的制備：將分子量為5000?Da的單甲氧基聚乙二醇15?g（3?mmol）溶于甲苯中，蒸餾出一部分甲苯以共沸除水，然后加入4?mmol的叔丁醇鉀回流反應1.5小時，而后緩慢加入4?mmol的溴乙酸乙酯回流反應3小時，然后室溫反應21小時，過濾除去沉淀后減壓蒸去溶劑，殘留物加少量二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出產物，將該產物溶于去離子水中，加入0.1?mol/L的氫氧化鈉溶液直到溶液的pH值穩定在pH10，然后用0.1?mol/L的鹽酸調節溶液的pH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥，濃縮后用乙醚沉淀干燥得到分子量為5000?Da的CM-PEG，分子式如下：CH3O-(CH2CH2O)n-CH2COOH。步驟2：脯氨酸乙酯鹽酸鹽的制備：將20?g?脯氨酸加入到300?mL無水乙醇中，在攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直到飽和，然后加入無水乙醇進行減壓蒸餾，將多余的氯化氫除去，接著將溶液濃縮至合適的體積，用干燥無水的乙醚沉淀得到脯氨酸乙酯鹽酸鹽。步驟3：合成以酰胺鍵連接的mPEG－脯氨酸綴合物：取7.5?g（1.5?mmol）步驟（1）中制備的CM-PEG溶于40?mL干燥的二氯甲烷中，然后依次加入2?mmol的二環己基碳二亞胺、2?mmol的脯氨酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的pH值調節到8，攪拌反應12小時，過濾除去沉淀后，加入無水乙醚沉淀產物，將產物干燥后溶于去離子水，加入0.1?mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種末端連接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯，其特征在于，結構如下：R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；R1可以是CH3－，也可以是R2R2的結構如下：R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亞胺基。688251dest_path_image001.jpg

【技術特征摘要】
1.一種末端連接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯，其特征在于，結構如下：
R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；
R1可以是CH3－，也可以是R2R2的結構如下：
R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亞胺基。
2.根據權利要求1所述的末端連接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯，其特征在于，所說的酸或酯為：
此處NHS代表N-羥基丁二酰亞胺。
3.根據權利要求1或2所述的末端連接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯的制備方法包括如下步驟：
（1）將聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇鉀回流反應1~2小時，加入溴乙酸乙酯回流反應2~4小時，然后室溫反應18~24小時，濃縮后用乙醚沉淀，沉淀物堿水解然后酸化，獲得CM-PEG；
（2）將氯化氫氣體通入含有脯氨酸的乙醇直到飽和，然后收集脯氨酸乙酯鹽酸鹽；
（3）取步驟（1）中制備的CM-PEG溶于二氯甲烷，然后依次加入二環己基碳二亞胺、脯氨酸乙酯鹽酸鹽，然后用三乙胺將溶液的pH值調節到8~9，反應8~12小時，過濾，濾液加入乙醚，收集沉淀產物，將產物干燥后溶于水，加入氫氧化鈉溶液調節pH至10~12，反應...

【專利技術屬性】
技術研發人員：熊玉春，李志成，羅宇，
申請(專利權)人：河南工業大學，
類型：發明
國別省市：