用于農桿菌介導的甘蔗轉化的方法技術

本發明專利技術提供了用于甘蔗（甘蔗屬）的農桿菌介導的轉化方法，該方法包括經由農桿菌介導的遞送，將一種感興趣的核苷酸序列引入甘蔗愈傷組織或其細胞中，其中該甘蔗愈傷組織低于起始后28天。本發明專利技術進一步提供了用于轉化甘蔗愈傷組織或其細胞的方法，該方法包括用包括用一種包含感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種該低于起始后28天的甘蔗愈傷組織，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；并且共培養該農桿菌和該甘蔗愈傷組織，以產生一種經轉化的甘蔗愈傷組織或其細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】優先權聲明本申請在35U.S.C.§119(e)下要求于2010年10月28日提交的美國臨時申請號61/407,584，以及2010年6月24日提交的美國臨時申請號61/358,148的權益，其全部內容通過引用結合在此。專利
本專利技術總體上涉及植物分子生物學，特別是用于農桿菌介導的甘蔗轉化的方法。背景甘蔗（甘蔗屬）是生長在從熱帶到亞熱帶的世界不同地區的一種高度多倍體的植物，并且占世界糖產量的約60%。在很多發展中/發達國家，它還是重要的經濟作物，具有高的貿易價值。近年來甘蔗的重要性已經增加，因為甘蔗是一種用于制糖工業和聯合工業產生乙醇、乙酸、丁醇、紙、合板、工業用酶以及動物飼料的重要原料?？紤]到它在農業產業中重要性，正做出一致努力使用生物技術方法用于對它的改進。根瘤農桿菌是一種土壤傳播的病菌，廣泛用于將異源的多核苷酸引入到植物細胞中，包括來自甘蔗的植物細胞中。根瘤農桿菌將一種腫瘤誘導（Ti）質粒的特定多核苷酸片段轉移入被感染的宿主細胞的細胞核中，其隨后穩定地整合入該宿主的基因組。有利的是，可以將異源的多核苷酸放置在Ti質粒或者用于此目的的經修飾的質粒的邊界之間，并將其轉移至植物細胞。盡管農桿菌介導的轉化已經被用于甘蔗的基因操作，可用方法的效率和重復性仍是一個挑戰。事實上，根瘤農桿菌在栽培、轉化甘蔗組織中誘導壞死，致使低轉化頻率（Arencibia等人，（1998）《轉基因研究》（Transgenic?Res.）7:123-222；Enriquez-Obregón等人，（1997）《生物技術應用》（BiotecnologíaAplicada）14:169-174；以及de?la?Riva等人（1998），《電子生物技術雜志》（Electron.J.Biotechno）1:118-133）。由于針對改進的特征（例如，增強的生物或者非生物性脅迫抗性或者改進的產量）而對甘蔗進行操作的重要性，存在著對另外的有力地增加這種重要的農業作物的農桿菌介導的轉化效率的方法的需求。因此，本專利技術人通過提供甘蔗的農桿菌介導轉化的方法，已經克服了現有技術的不足，這些方法導致更高的轉化效率。專利技術概述提供了用于甘蔗（甘蔗屬）的農桿菌介導的轉化方法，其中使用農桿菌介導的轉化對非常幼小的甘蔗組織或其細胞進行轉化。因此，本專利技術的一個第一方面提供了一種轉化甘蔗愈傷組織或其細胞的方法，該方法包括經由農桿菌介導的遞送，將一種感興趣的核苷酸序列引入甘蔗愈傷組織或其細胞中，其中該甘蔗愈傷組織低于起始后28天。本專利技術的一個第二方面提供了一種轉化甘蔗組織和/或其細胞的方法，該方法包括：(a)用一種包括感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種一種低于起始后28天的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；以及(b)共培養該經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經轉化的甘蔗愈傷組織或其細胞。在一個另外的方面，本專利技術提供了一種轉化甘蔗組織和/或其細胞的方法，該方法包括：(a)用一種包括感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種一種低于起始后28天的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；以及(b)共培養該經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經轉化的甘蔗愈傷組織或其細胞，其中轉化率得以提高。在另外的方面，本專利技術提供了一種轉化甘蔗組織和/或其細胞的方法，該方法包括：(a)用一種包括感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種一種低于起始后28天的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；以及(b)共培養該經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經轉化的甘蔗愈傷組織或其細胞，其中甘蔗植物的再生得以提高。在其他的方面，本專利技術提供了一種轉化甘蔗組織和/或其細胞的方法，該方法包括：(a)用一種包括感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種一種低于起始后28天的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；以及(b)共培養該經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經轉化的甘蔗愈傷組織或其細胞，其中核酸遞送得以提高。專利技術詳細說明現在，將在下文中更加充分地描述本專利技術。然而，本專利技術能以不同的形式實施，并且不應當被理解為局限于在此列出的這些實施方案中。相反地，提供了這些實施方案，這樣使得本披露將是徹底的和完整的，并且將充分地向本領域的普通技術人員傳達本專利技術的范圍。除非另外定義，在此所使用的全部術語（包括技術術語和科學術語）具有與屬于本專利技術的領域之內的普通技術人員通常所理解的相同的意義。應該進一步理解的是，除非清楚地在此如是定義，術語（如那些在通用詞典中定義的）應當被解釋為具有與它們在本申請的上下文中以及相關領域中的意義一致的意義，并且不應當被解釋為理想化的或過于正式的意義。本專利技術是針對農桿菌介導的轉化方法，該方法包括幼小的甘蔗組織和/或其細胞的使用，它可以允許轉化來自農桿菌的感興趣的核苷酸序列進入經接種的甘蔗組織和/或細胞的效率提高。出人意料地，本專利技術人已經發現，將甘蔗的幼小組織用于農桿菌介導的轉化致使轉化率的提高和/或經轉化的甘蔗植物的再生提高。另一個益處是使用這些方法產生的組織可以縮短用于轉化所需要的時間-意味著可以花費較短的時間形成轉基因植物并且可以不作為轉化效率的提高來進行測量是一個益處。因此，本專利技術的一個第一方面提供了一種轉化甘蔗愈傷組織或其細胞的方法，該方法包括經由農桿菌介導的遞送，將一種感興趣的核苷酸序列引入甘蔗愈傷組織或其細胞中，其中該甘蔗愈傷組織低于起始后28天。本專利技術的一個第二方面提供了一種轉化甘蔗組織和/或其細胞的方法，該方法包括：(a)用一種包括感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種一種低于起始后28天的甘蔗組織和/或其細胞，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；以及(b)共培養該經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經轉化的甘蔗愈傷組織或其細胞。除非在文中另外指明，在此描述的本專利技術的不同特征是明確地意在能以任意組合使用。如在此使用的，“大約”意為一種值處于統計學上有意義的范圍之內，比如一種說明的濃度范圍、時間范圍、重量（例如，一種百分比變化（重量的減少或增加））、體積、溫度或pH。這樣的范圍可以在給定值或給定范圍的一種數量級之內，典型地在20%之內，更典型地在10%之內，并且甚至更典型地在5%之內?！按蠹s”所包括的可允許的變化將取決于研究的具體系統，并且可以易為本領域內的普本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.06.24 US 61/358,148;2010.10.28 US 61/407,5841.一種轉化甘蔗愈傷組織或其細胞的方法，該方法包括經由農桿菌介
導的遞送，將一種感興趣的核苷酸序列引入甘蔗愈傷組織或其細胞中，其中
該甘蔗愈傷組織或其細胞低于起始后28天。
2.一種轉化甘蔗組織或其細胞的方法，該方法包括：
（a）用包括一種感興趣的核苷酸序列的農桿菌接種一種低于起始后28
天的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞；以
及
（b）共培養該經農桿菌接種的甘蔗組織或其細胞，以產生一種經轉化
的甘蔗愈傷組織或其細胞。
3.以上權利要求中任何一項所述的方法，其中該甘蔗組織低于大約起
始后23天。
4.以上權利要求中任何一項所述的方法，其中該甘蔗組織處于起始后
大約6天至大約23天。
5.權利要求1至3中任何一項所述的方法，其中該甘蔗組織處于起始后
大約1天至大約14天。
6.權利要求1至3中任何一項所述的方法，其中該甘蔗組織處于起始后
大約6天至大約14天。
7.以上權利要求中任何一項所述的方法，其中該細菌是根瘤農桿菌。
8.權利要求2中所述的方法，其中將該經農桿菌接種的甘蔗愈傷組織
或其細胞在不存在共培養基的表面上進行共培養一段時間，這段時間足以降
低所述經農桿菌接種的甘蔗...

【專利技術屬性】
技術研發人員：RJC蓋杰斯克斯，PC德魯卡，
申請(專利權)人：先正達參股股份有限公司，昆士蘭科技大學，
類型：
國別省市：