主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體，由作為載體骨架的可生物降解的高分子化合物分別與作為載體側鏈的靶分子和氨基化合物共價偶聯得到。該載體能與siRNA自組裝形成復合物納米粒，將siRNA緊密包裹起來，防止核酸酶對siRNA的降解。另外，該載體中的靶分子能與腫瘤細胞表面的抗原或受體發生特異性相互作用，從而實現將載體-siRNA復合物納米粒精準地靶向輸送至腫瘤部位，通過抗原或受體介導的細胞內吞作用進入癌細胞，在胞內通過siRNA誘導基因沉默復合物的生成，序列特異性降解mRNA，使目的蛋白表達量下調，從而達到殺死癌細胞，實現治療腫瘤的目的。本發明專利技術還提供了該主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體的制備方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種小干擾核糖核酸輸送載體，具體涉及一種。
技術介紹
RNA干擾是由雙鏈RNA引發的序列特異性的轉錄后基因沉默機制。長度約為20個堿基對的小干擾核糖核酸(siRNA)是RNA干擾的效應分 子，在胞內誘導生成基因沉默復合物，序列特異性降解mRNA，從而阻斷目標基因的活性。利用siRNA使基因沉寂而調節目的蛋白功能，在很多疾病的基因治療中有巨大的應用潛力，如神經退行性疾病、癌癥、傳染病等。siRNA作為一種新藥物已經顯示出了巨大的應用前景，目前一些生物制藥公司已經致力于siRNA藥物研發，但目前世界上還沒有一例siRNA藥物成功上市，這主要是因為siRNA的血漿半衰期短、生理條件下容易被降解、難以輸送至細胞質、并且缺乏靶向能力，因此，siRNA的靶向輸運是其能否成功上市的關鍵瓶頸，設計和合成安全有效的siRNA輸運載體已經成為目前siRNA藥物研發的重要方向。為了克服上述難題，目前已經報道的siRNA輸送載體主要有以下四類1)陽離子脂質體類；2)陽離子聚合物類；3)多肽類偶聯物；4)抗體融合蛋白體系。這些輸送體系能夠保護siRNA不被核酸酶降解、有利于siRNA被靶細胞攝取、并具有體內基因沉默效果。其中，由兩親性陽離子聚合物自組裝形成的納米粒子已經被證明能夠輸送質粒DNA、反義寡核苷酸和siRNA，是核酸輸送載體中最有希望的一類。該類載體能夠通過離子相互作用裝載核酸、保護其不被核酸酶降解、同時提高細胞攝取。新加坡生物工程與納米技術研究所楊毅嚴教授課題組報道了一種陽離子納米粒子及其PEG化衍生物，能輸送質粒DNA，在一系列癌細胞中獲得高基因表達率。中國科學技術大學王均教授課題組報道了一種可生物降解的兩親性的三嵌段陽離子共聚物，該共聚物作為siRNA輸送載體能靶向酸性神經酰胺酶基因以治療癌癥，該三嵌段共聚物為甲基聚乙二醇-聚己內酯-聚-2-胺乙基磷酸乙二醇。新澤西州立大學Tamara Minko教授課題組報道了一種多功能的新型三嵌段共聚物納米載體，可用于有效的siRNA輸送和基因沉默，該共聚物為聚酰胺-聚乙二醇-聚賴氨酸。但是，這些siRNA輸送載體在生理條件下，對目標部位的靶向性仍然不夠好。在siRNA輸送載體上連接上靶分子，可以提高siRNA輸送載體對目標部位的靶向性。北京大學羅瑩教授課題組報道了一種中性的交聯了的樹枝狀siRNA輸送體系，該樹枝狀siRNA輸送體系主體為聚酰胺樹枝狀聚合物，其末端氨基上修飾了酰肼和乙酰半乳糖胺，修飾后的樹枝狀聚合物可以與siRNA通過離子相互作用形成復合物，最后用戊二醛對復合物進行交聯，以保護siRNA不被降解，體系中半乳糖胺可起到受體介導的主動靶向作用，提高siRNA的靶向輸送和基因沉默效果。但是，該載體與siRNA的結合能力不夠強，最后需要使用戊二醛對復合物進行交聯，以保護siRNA不被降解。根據上述siRNA輸 送載體的國內外研究現狀分析，設計和合成安全有效的siRNA輸運載體、提高siRNA對腫瘤組織的靶向性是研究的主要趨勢。
技術實現思路
本專利技術提供了一種，該主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體能有效避免siRNA被核酸酶降解，將siRNA高特異性靶向輸送至腫瘤部位。一種主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體，由作為載體骨架的可生物降解的高分子化合物與作為載體側鏈的靶分子和氨基化合物共價偶聯得到；所述的高分子化合物、靶分子和氨基化合物含有能發生共價偶聯的反應官能團；所述的高分子化合物為具有羧基或者氨基反應官能團的、可生物降解的、無細胞毒性的天然大分子化合物或人工合成的高分子化合物；所述的靶分子為與腫瘤細胞有特異性相互作用的分子；所述的氨基化合物為仲胺、叔胺或季銨鹽化合物。本專利技術中，所述的氨基化合物為仲胺、叔胺或季銨鹽化合物分子，這類分子在pH中性條件下帶正電荷，與siRNA有強結合能力，從而使siRNA輸送載體能夠結合siRNA并將其包裹起來形成載體-siRNA復合物納米粒,保護siRNA在體內輸送過程中不被降解。所述的靶分子能與腫瘤細胞表面的抗原或受體發生特異性相互作用，實現將載體-siRNA復合物納米粒精準地靶向輸送至腫瘤部位，通過抗原或受體介導的細胞內吞作用進入癌細胞，在胞內通過siRNA誘導基因沉默復合物的生成，序列特異性降解mRNA，使目的蛋白表達量下調，從而達到殺死癌細胞治療腫瘤的目的。所述的高分子化合物為具有羧基或者氨基等反應官能團的、可生物降解、無細胞毒性的天然大分子或人工合成的高分子。所述的高分子化合物含有羧基或氨基等反應官能團，可進一步用靶分子和氨基化合物來修飾；載體骨架的可生物降解性和無細胞毒性是作為藥物輸送載體的必要條件。所述的高分子化合物優選為海藻酸鈉、殼聚糖或聚賴氨酸，更優選為天然高分子化合物海藻酸鈉或殼聚糖，最優選為海藻酸鈉。本領域人員熟知的能與腫瘤細胞表面的抗原或受體發生特異性相互作用的靶分子都能應用于本專利技術，為了所述的靶分子能順利地連接至所述的載體骨架上，靶分子優選為單克隆抗體、葉酸配體、半乳糖胺配體或RGD短肽，所述的RGD短肽為含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽。為了使得所述的氨基化合物能連接到所述的載體骨架上，所述的氨基化合物含有-NH2、醛基或羧基等反應官能團。此外，所述的氨基化合物還能起到質子海綿的作用，在所述的載體-siRNA復合物納米粒通過胞吞作用進入癌細胞后，內涵體表面的質子泵會將細胞質中的質子泵入內涵體中，由于復合物納米粒的質子海綿作用，泵入的質子會被載體-siRNA復合物納米粒吸收，由于滲透壓的提高，細胞質中的水會持續進入內涵體，從而使內涵體脹破而釋放出復合物納米粒，逃離溶酶體途徑。所述的氨基化合物優選為組胺、組胺醇、5-氨基咪唑-4-甲酰胺、2-(2-甲基咪唑基)乙胺、4-咪唑甲醛、組氨酸和咪唑乳酸中的至少一種。以骨架大分子為海藻酸鈉、氨基化合物為組胺、靶分子為半乳糖胺為例，半乳糖胺-海藻酸鈉-組胺主動靶向輸送siRNA的機理如圖I所示。本專利技術中，所述載體骨架上連接的氨基化合物與靶分子的數目比為O. 05-5. O 1，優選為O. 1-1.0 I。此時，所述的氨基化合物能高效地通過離子相互作用結合siRNA,形成載體-siRNA復合物納米粒,而所述的祀分子也能以較高的效率特異性革巴向腫瘤細胞，提高siRNA的靶向輸送效果。本專利技術還提供了所述的主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體的制備方法，包括(I)使所述的高分子化合物與所述的氨基化合物和所述的靶分子中任意一個發生共價偶聯反應得到中間體；(2)使步驟(I)得到的中間體與所述的氨基化合物和所述的靶分子中另一個發生共價偶聯反應，反應完全之后，經純化得到所述的主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體。當所述的高分子化合物的反應官能團為羧基時(如海藻酸鈉)，所述的主動靶向型siRNA輸送載體的制備方法包括以下步驟(I)用EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)活化所述高分子化合物中的羧基，通過氨基與羧基的共價偶聯反應在大分子骨架上共價偶聯一種具有氨基的靶分子，如單克隆抗體或半乳糖胺等配體，得到中間體；(2)在步驟(I)得到的中間體上共價偶聯一種或幾種氨基化合物，如組胺、組胺醇、5-氨基咪唑-4-甲酰胺或2-(2-甲基咪唑基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種主動靶向型小干擾核糖核酸輸送載體，其特征在于，由作為載體骨架的可生物降解的高分子化合物與作為載體側鏈的靶分子和氨基化合物共價偶聯得到；所述的高分子化合物、靶分子和氨基化合物含有能發生共價偶聯的反應官能團；所述的高分子化合物為具有羧基或者氨基反應官能團的、可生物降解的、無細胞毒性的天然大分子化合物或人工合成的高分子化合物；所述的靶分子為與腫瘤細胞有特異性相互作用的分子；所述的氨基化合物為仲胺、叔胺或季銨鹽化合物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：沈折玉，吳愛國，任文智，馬雪華，
申請(專利權)人：中國科學院寧波材料技術與工程研究所，
類型：發明
國別省市：