本發明專利技術公開了一種基于點擊化學仿生分子印跡電化學傳感器的制備及對食品過敏原的檢測方法。選擇與電極表面固定的疊氮烷基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜；通過點擊化學反應，對疊氮端基的自組裝單層膜進行端基烯基功能化；選擇能與過敏原反應合成過敏原人工抗體的MIPs的功能單體；利用現有方法制備出石墨烯材料，摻入到人工抗體的制備；按一定物質的量比將食品過敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑混合均勻制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物(MIPs)；將制得的分子印跡聚合物修飾工作電極連接到電化學工作站，對食品提取液中的食品過敏原進行檢測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及食品過敏原檢測
，更具體地說是一種能夠檢測食品過敏原的電化學傳感器制備，本專利技術還涉及采用所述的仿生分子印跡技術測定樣品中痕量食品過敏原的方法。
技術介紹
食品過敏原現已成為一個新興的公眾性食品安全問題，特別是在發達國家，調查顯示全世界范圍內有超過1%的成年人對食品過敏，而嬰幼兒和兒童發生率達到了 5%-10%。一般來說，食品過敏原為分別屬于不同家族的蛋白或糖蛋白，微量的食品過敏原蛋白即可 引起嚴重的過敏反應。近年來，國際食品法典委員會、各發達國家紛紛出臺了各種食品過敏原標識的法規、標準和相應的實施措施，其中以美國和歐盟的尤為嚴格，已經進入了強制性實施階段，這對我國農產品、食品進出口貿易帶來了不容忽視的影響。我國也于2008年奧運會期間正式開展了食品過敏原檢測和相關標準制定工作。目前系統全面精確可靠的食品中過敏原檢測和分析技術體系形成迫在眉睫。過敏原反應是由過敏原入侵人體內而致,引起過敏反應的反應原一般為具有酸性等電點的蛋白或糖蛋白。過敏原在食品的加工處理中表現出極大的穩定性，通過一般加工手段如加熱、超高壓、烘烤、干燥后其酶活性仍然存在，尚具備一定程度的致敏性，這是食品安全上的一個難題。世界糧油組織1995年報告，90%以上的食物過敏反應是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產品、花生、大豆、果仁和小麥8類食物引起，10%的過敏原是由170多種其他食物引起。檢測過敏原的方法主要有I)體內檢查，如皮膚試驗(劃痕試驗，點刺試驗,皮內注射試驗)和激發試驗(氣道粘膜、結膜激發反應)；2)體外檢查，如嗜堿性粒細胞脫顆粒試驗、放射免疫吸附試驗(RIST)、放射變應原吸附試驗(RAST)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。其中應用最為廣泛的方法是皮膚試驗，它為過敏癥診斷可提供快速但卻是非定量的結果，而無論對醫生還是病人來講，體外診斷無疑是方便和可靠的，但由于ELISA檢測試劑盒和試條，存在復雜的抗體制備過程，價格較為昂貴；PCR技術雖具有開發前景，但是食品處理過程中DNA的變性作用和該方法的最大檢測限度限制了其在當前的應用和發展。迫切需要開發各種特異性強、靈敏度高、速度快、成本低、檢測面廣的分析檢測方法和技術來適應形勢的發展。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于點擊化學仿生分子印跡食品過敏原快速檢測傳感器的制備及應用，本專利技術以仿生分子印跡膜為基礎，建立了食品過敏原的電化學仿生免疫傳感快速檢測方法，成功建立了快速、特異、靈敏的檢測食品過敏原的傳感器。為了解決上述技術問題，本專利技術是通過以下措施來實現的一種基于點擊化學仿生分子印跡電化學傳感器的制備及對食品過敏原的檢測，其特征是包括以下步驟 (O 選擇與電極表面固定的疊氮燒基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜； (2)通過與丙烯酸丙炔酯點擊化學反應，對疊氮端基的自組裝單層膜進行端基烯基功能化； (3)選擇能與過敏原反應合成過敏原仿生分子印跡聚合物(MIPs)的功能單體； (4)利用現有方法制備出石墨烯材料，摻入到仿生分子印跡聚合物； (5)按一定物質的量比將食品過敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑混合均勻，制備分子印跡聚合物溶液； (6 ) 將分子印跡聚合物溶液滴于經過(2 )處理過的電極表面，紫外光引發制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物； 本專利技術所述食品過敏原仿生分子印跡聚合物的模板分子、功能單體、交聯劑、致孔齊U、引發劑和有機溶劑的物質的量比為O. I I : I : O. 5 5 20 55 O. 05 O.2 : I. 5 30，每毫升中摻入IOmg石墨烯。本專利技術所述摻有石墨烯材料的仿生分子印跡聚合物制備的傳感器檢測痕量食品過敏原的方法，將按上述任意一種方法制得的分子印跡聚合物通過點擊化學修飾于工作電極制備電化學傳感器，對食品提取液中的食品過敏原進行檢測，其特征是包括如下步驟 (1)含過敏原食品經正己烷4°C浸提過夜，冷凍離心，收集上清液，用30%_50%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH 5. 2或pH4. 5等電點，離心后沉淀物溶解在PBS中，得到食品過敏原； (2)將所用金電極(Φ=4ι πι)用O. 05 μ m的招粉進行拋光,用piranha溶液(H2SO4/H202=3:1)浸泡5min，二次蒸餾水洗滌，氮氣氣氛干燥，將清洗過的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內進行循環伏安掃描至穩定，再用二次蒸餾水清洗干凈，氮氣氣氛下干燥4°C保存使用； (3)將(2)處理過的金電極,在lmmol/L硫代癸燒和2mmol/L疊氮^ 燒基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮氣吹干； (4)將步驟(3)處理過的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有抗壞血酸和硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌，然后二次蒸餾水洗滌，晾干； (5)將步驟(4)處理過的工作電極晾干后滴加MIPs溶液20μ L，紫外光(365nm)下誘導聚合反應lh，然后將工作電極用洗脫劑洗脫10-15分鐘，在室溫下干燥5-10分鐘，成功制備過敏原仿生分子印跡膜電化學傳感器，保存在4°C的冰箱中備用； (6)將制得的過敏原分子印跡膜電極連接到電化學工作站，對樣品提取液中的過敏原進行檢測。所述的置氣燒基硫醇為置氣十一燒基硫醇，丙稀酸丙塊酷對置氣端基的自組裝單層膜進行端基烯基功能化。所述的仿生分子印跡電化學傳感器的工作電極為金電極(Φ=4πιπι)； 所述的模板食品過敏原可以是水溶性并與功能單體、交聯單體相容； 所述的功能單體為丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酰胺(MAM)、丙烯酸(ΑΑ)、甲基丙烯酸(MAA)或4-乙烯基吡啶(4-VP)； 所述交聯劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3，5_ 二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)； 所述的引發劑是可以引起聚合反應但不使模板蛋白發生變性的所有引發劑包括熱引發劑和光引發劑，包括偶氮二異丁腈、過硫酸鉀、過硫酸銨、二乙基二硫代氨基甲酸鈉等；所述致孔劑采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇； 所述有機溶劑為二氯甲烷或四氯化碳； 所述洗脫液為可以將模板蛋白從印跡膜上洗脫的緩沖溶液、鹽溶液、堿溶液和變性劑等，包括各種濃度的磷酸鹽緩沖溶液或NaCl鹽溶液和NaOH堿溶液或變性劑十二烷基硫酸鈉等。具體實施方式·實施例I :花生過敏原的檢測 (1)稱取花生30g，使用組織破碎機破碎得粉末，按重量體積比g/mL為1:10浸入正己烷中脫脂，4°C浸提過夜，冷凍離心，收集上層蛋白浸液，IOmL蛋白浸液緩慢加至質量濃度30%的飽和硫酸銨，4°C下靜置過夜，離心沉淀，對上層清液再緩慢加至質量濃度50%飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%-50%飽和度沉淀的蛋白質組分溶解在PBS中，加硫酸至PH5. 2等電點，離心后沉淀物溶解在PBS中，裝入透析袋對蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉至PBS中繼續透析，即得花生過敏原待測液，取待測液ImL加入傳感反應池中進行檢測； (2)選擇能與花生過敏原合成仿生分子印跡聚合物的功能單體丙烯酰胺(AM)； (3)石墨烯材料溶液本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于點擊化學食品過敏原仿生分子印跡電化學傳感器的制備及應用，其特征是包括以下步驟：（1）選擇與電極表面固定的疊氮烷基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜；（2）通過點擊化學反應，對疊氮端基的自組裝單層膜進行端基烯基功能化；（3）選擇能與過敏原反應合成過敏原仿生分子印跡聚合物(MIPs)的功能單體；利用現有方法制備出石墨烯材料，摻入到仿生分子印跡聚合物；（5）按一定物質的量比將食品過敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑混合均勻，制備分子印跡聚合物溶液；（6）將分子印跡聚合物溶液滴于經過（2）處理過的電極表面，紫外光引發制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：葛慎光，顏梅，于京華，葛磊，黃加棟，張彥，楚成超，王盼盼，劉芳，劉偉艷，孫國強，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：
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