本發明專利技術涉及一種應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，其特征在于，包括如下步驟：1）將分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行無血清懸浮適應培養；2）在生物反應器內分兩階段培養所述雜交瘤細胞；3）收獲培養上清液；4）超濾、凍干，制得成品。本發明專利技術應用生物反應器懸浮培養生產單克隆抗體的方法，克服了動物體內制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體方法中所存在的產品雜蛋白含量高、質量不穩定、批間差大等缺陷，并具有培養基成分明確、方法和過程可控、抗體純度高、操作簡便、生產效率高等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及單克隆抗體
，具體涉及。
技術介紹
犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的一種高度接觸性傳染病，俗稱狗瘟，該病的傳染性極強，死亡率高達80%以上。接種犬瘟熱疫苗是預防犬瘟熱最為有效的途徑之一。近年來，在廣泛應用犬瘟熱疫苗防治犬瘟熱的同時，世界各地仍有犬或野生動物感染犬瘟熱病毒，并造成犬瘟熱流行的報道，且犬瘟熱病毒的變異使得痊愈犬仍可傳染犬瘟熱病毒。單克隆抗體具有特異性高、靈敏性好和重復性優等特點，常用于診斷和治療犬瘟 熱病毒引起的相關疾病。其中，抗犬瘟熱病毒的單克隆抗體為犬瘟熱的診斷和治療提供良好的基礎。此外，抗犬瘟熱單克隆抗體對犬瘟熱的臨床診斷、流行病學調查、病原學研究等方面都有積極和重要的意義。迄今為止，抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備方法主要采用動物體內培養法，所使用的生產動物多為BALB/c小鼠，具體步驟為1)將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，雜交瘤細胞在小鼠腹腔內生長并產生腹水；2)從所產生的腹水中提取分離雜交瘤細胞所生成的單克隆抗體。該方法制得的單克隆抗體濃度高，且具有操作簡便、經濟等優點，但產量有限，無法實現工業規模化生產，同時腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白(包括IgG)，需要提純后才能使用，并有污染動物病毒的危險。因此，急需研究新的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，本專利技術的方法克服了傳統動物體內生產工藝產品雜蛋白含量高、產品質量不穩定、批間差大等缺陷，具有培養基成分明確、過程和質量可控、抗體純度高、操作簡便、生產效率高、廣品純度聞、穩定性好等優點。本專利技術的技術方案為，包括如下步驟I)將分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行無血清懸浮適應培養；2)在生物反應器內分兩階段培養所述雜交瘤細胞；3)收獲培養上清液；4)將收獲的上清液進行超濾、凍干，制得抗犬瘟熱病毒單克隆抗體成品。本專利技術的優選技術方案中，所述雜交瘤細胞株選自能夠穩定分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的鼠雜交瘤細胞株，優選所述的鼠雜交瘤細胞株為HB-216雜交瘤細胞株。本專利技術的優選技術方案中，步驟2)中在生物反應器內分兩階段培養雜交瘤細胞包括雜交瘤細胞的細胞生長階段和抗體分泌階段，其中，細胞生長階段以獲取細胞量為主，抗體分泌階段以持續獲得大量分泌性抗體為主。本專利技術的優選技術方案中，所述細胞生長階段的培養條件為溫度為36°C -37攪拌轉速為 120 RPM -180RPM、溶氧(DO)為 30%_80% 和 pH 為 7. 0-7. 2。本專利技術的優選技術方案中，所述抗體分泌階段的培養條件為溫度為34°C -35攪拌轉速為 120RPM-180RPM、溶氧(DO)為 30%_80% 和 pH 為 7. 2-7. 4。本專利技術的優選技術方案中，所述生物反應器選自攪拌式生物反應器、激流式生物反應器中的任一種或其組合。本專利技術的優選技術方案中，步驟2 )生物反應器內分兩階段培養所用的培養基選自Hybridoma-SFM無血清培養基、PFHM-II無血清培養基中的任一種或其組合。本專利技術的優選技術方案中，步驟2)中生物反應器內的培養方法選自分批培養法、 補料分批培養法、灌注培養法中的任一種或其組合。本專利技術的優選技術方案中，所述分批培養法為在生物反應器內放入一定量的培養基后，接入適量細胞，使其生長繁殖，一次性收獲產品。本專利技術的優選技術方案中，所述補料分批培養法為在分批培養過程中補加新鮮的培養基或營養物質，一次性收獲產品，其中，補料所用培養基為原倍培養基或濃縮了 2-5倍的培養基，優選為濃縮了 3-4倍的培養基，并間歇補加營養物質或流加營養物質，其中，所述的營養物質選自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、乳清蛋白水解物的任一種或其組合。本專利技術的優選技術方案中，所述灌注培養法為細胞接種生物反應器后所進行的培養，新鮮的培養基不斷加入生物反應器，同時又連續不斷的排出廢液或連續收獲產品，其中，優選的灌注體積為O. 5-3個工作體積/天，通過更改蠕動泵轉速來調節灌注速率。本專利技術的優選技術方案中，步驟2)中生物反應器內的培養方法選自單級培養法、逐級放大培養法的任一種或其組合，單級培養法優選為14L單級培養法、逐級放大培養法優選為14L-75L-650L逐級放大培養法。本專利技術的優選技術方案中，所述14L單級培養法以搖瓶培養細胞為種子細胞，將其接種到14L攪拌式生物反應器中進行培養，并產生抗體。本專利技術的優選技術方案中，所述14L-75L-650L逐級放大培養法以14L生物反應器培養細胞為種子細胞，再將種子細胞放大到75L生物反應器中培養，再以75L生物反應器中培養的細胞作為種子細胞，將其放大到650L生物反應器進行培養，并產生抗體。本專利技術的優選技術方案中，步驟3 )所述的收獲培養上清液為收獲抗體上清，其中，所述培養上清液的收獲法選自批式收獲法、間歇收獲法、連續收獲法中的任一種或其組合，優選為連續收獲法。本專利技術的優選技術方案中，步驟4)所述的超濾是指將收獲的抗體上清進行抗體超濾濃縮，其中，超濾所用膜包的孔徑選自5kD超濾膜、8kD超濾膜的任一種或其組合。為了清楚地表述本專利技術的保護范圍，本專利技術對下述術語進行如下界定本專利技術所述的“生物反應器”是指通過體外模擬微生物體內生長及代謝環境的一種具有生物功能的設備，其包括但不限于本專利技術所述的“攪拌式生物反應器”或“激流式生物反應器”。本專利技術所述的“生物反應器放大”是指在利用生物反應器培養細胞的過程中，將各項指標(包括細胞生長動力學、熱力學、細胞代謝及細胞生理狀態等)從小規模生物反應器放大到大規模生物反應器上進行再現或者加以優化的一項綜合性技術。一般通過優化生物反應器的物理結構、建立數學模型及代謝調控策略來實現生物反應器的放大過程，其包括但不限于本專利技術所述的“生物反應器逐級放大”。本專利技術所述的“雜交瘤細胞”是將具有無限分裂、增殖能力的SP2/0骨髓瘤細胞和具有抗犬瘟熱病毒抗體 分泌功能的小鼠脾淋巴細胞經聚乙二醇(PEG)介導細胞融合而成，所形成的雜交瘤細胞同時具有無限增殖和抗體分泌兩種細胞特性，包括但不限于本專利技術實施例所例舉的HB-216雜交瘤細胞。除非另有說明，本專利技術涉及液體與液體之間的百分比時，所述的百分比為體積/體積百分比；本專利技術涉及液體與固體之間的百分比時，所述百分比為體積/重量百分比；本專利技術涉及固體與液體之間的百分比時，所述百分比為重量/體積百分比；其余為重量/重量百分比。與現有技術相比，本專利技術具有下述有益技術效果I、本專利技術提供了一種應用生物反應器無血清懸浮培養雜交瘤細胞以制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，該方法不在培養基中添加牛血清，從而避免了牛血清對抗體分泌的影響，也克服了血清中異種蛋白的殘留(如導致過敏反應)對抗犬瘟熱病毒單克隆抗體質量的影響，并避免了污染動物病毒的風險，且所制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體具有組分明確，產品質量優等優點。2、本專利技術的制備方法將雜交瘤細胞在生物反應器中分兩階段培養，包括細胞生長階段和抗體分泌階段，其中，細胞生長階段獲得了大量的細胞質，抗體分泌階段持續大量地獲取了分泌性單克隆抗體，顯著優化了細胞的生長及抗體的分泌表達，有效地改善和提高了抗體的表達水平。3、本專利技術采用單級培養法或逐級放大培養法，實現了制備過程的自動化控制，大大降低了生產成本，提高了產品的質量本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，其特征在于包括如下步驟：1）將分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行無血清懸浮適應培養；2）在生物反應器內分兩階段培養所述雜交瘤細胞；3）收獲培養上清液；4）將收獲的上清液進行超濾、凍干，制得抗犬瘟熱病毒單克隆抗體成品。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李偉，劉潔，秦紅剛，漆世華，溫文生，朱薇，謝紅玲，韓興，王楨楨，廖園園，李建，王威，
申請(專利權)人：武漢中博生物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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