【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域，具體而言，涉及一種以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因玉米育種方法。
技術(shù)介紹
轉(zhuǎn)基因育種已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的一種重要手段。從80年代后期科學(xué)家開始進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)基因研究，至今已經(jīng)取得一些重要成果。國外已經(jīng)有部分商業(yè)化種植的玉米轉(zhuǎn)基因品種，例如高賴氨酸轉(zhuǎn)基因玉米，抗玉米螟轉(zhuǎn)基因玉米，抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米等。而國內(nèi)成功的例子還相對較少，轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于美國等發(fā)達(dá)國家。在玉米轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法是以幼胚和幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。此類方法的特點(diǎn)是受體為二倍體的玉米材料，且須經(jīng)歷幼胚脫分化和再分化等復(fù)雜的組織培養(yǎng)過程。存在以下缺點(diǎn)(I)不同基因型玉米幼胚的脫分化和再分化能力具有很大差異，很多生產(chǎn)上使用的骨干自交系由于甚至不能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，或者再分化效率極低，而不能作為轉(zhuǎn)化受體，這限制了轉(zhuǎn)基因玉米受體基因型的選擇范圍；(2)基因轉(zhuǎn)化效率低，如果沒有龐大的受體系統(tǒng)難以獲得足夠的轉(zhuǎn)化事件，篩選出目的基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化體幾率非常小；(3)目的基因遺傳不穩(wěn)定，基因沉默和基因丟失現(xiàn)象比較常見，難以獲得目標(biāo)性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系；(4)以二倍體玉米作為受體材料獲得的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因植株其目的基因在同源染色體上處于雜合狀態(tài)，必須經(jīng)過2代以上的自交才能獲得純合穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，導(dǎo)致獲得轉(zhuǎn)基因純合的株系周期太長。近年來也開展了以植物單配體為受體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因研究。在煙草和大麥的上，以雌雄配子體及其培養(yǎng)形成的單倍體愈傷組織為受體已成功獲得了陽性轉(zhuǎn)化事件；利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行花粉和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞或愈傷組織，進(jìn)一步分化...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法，包括如下步驟：(1)用單倍體誘導(dǎo)系stock6做為父本，以西南地區(qū)玉米骨干自交系18？599作為母本，進(jìn)行雜交組配并收獲F1代雜交種，從獲得的種子中挑選胚乳頂部為紫色而胚為白色的種子，該種子大部分為單倍體；棄去胚乳頂部和胚均為紫色的二倍體種子；(2)對獲得的單倍體種子進(jìn)行消毒，然后在培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗條件下培養(yǎng)，待胚芽生長到2～4cm：(3)以含目的基因的表達(dá)載體制備含目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌并制備成侵染液；(4)切單倍體莖尖：在超凈工作臺上墊上提前滅過菌的濾紙，然后從培養(yǎng)基上用鑷子取出步驟(2)中待轉(zhuǎn)化的發(fā)芽植株，用手術(shù)刀先切去種子胚根，在莖節(jié)鼓起處以上1毫米左右的部分橫向微切，輕輕剝?nèi)ヅ哐壳事冻銮o尖生長點(diǎn)，再從中部縱向切傷莖尖生長點(diǎn)，傷口深度約1mm；(5)農(nóng)桿菌侵染莖尖：擺放好莖尖的培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，并墊上泡沫塑料使其向莖尖一邊傾斜，然后農(nóng)桿菌侵染液滴加在培養(yǎng)皿中莖尖一方，使莖尖能完全接觸菌液，完全蓋上真空干燥器蓋子，在30？70kPa壓力下侵染6～12min；(6)共培養(yǎng)：侵染結(jié)束后，用吸管快速吸凈培養(yǎng)皿上多余的...
【技術(shù)特征摘要】
1.以單倍體玉米莖尖為受體的轉(zhuǎn)基因育種方法，包括如下步驟(1)用單倍體誘導(dǎo)系stock6做為父本，以西南地區(qū)玉米骨干自交系18-599作為母本， 進(jìn)行雜交組配并收獲Fl代雜交種，從獲得的種子中挑選胚乳頂部為紫色而胚為白色的種子，該種子大部分為單倍體；棄去胚乳頂部和胚均為紫色的二倍體種子；(2)對獲得的單倍體種子進(jìn)行消毒，然后在培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗條件下培養(yǎng)，待胚芽生長到2 4cm (3)以含目的基因的表達(dá)載體制備含目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌并制備成侵染液；(4)切單倍體莖尖在超凈工作臺上墊上提前滅過菌的濾紙，然后從培養(yǎng)基上用鑷子取出步驟(2)中待轉(zhuǎn)化的發(fā)芽植株，用手術(shù)刀先切去種子胚根，在莖節(jié)鼓起處以上I毫米左右的部分橫向微切，輕輕剝?nèi)ヅ哐壳事冻銮o尖生長點(diǎn)，再從中部縱向切傷莖尖生長點(diǎn)，傷口深度約Imm ；(5)農(nóng)桿菌侵染莖尖擺放好莖尖的培養(yǎng)皿置于真空干燥器中，并墊上泡沫塑料使其向莖尖一邊傾斜，然后農(nóng)桿菌侵染液滴加在培養(yǎng)皿中莖尖一方，使莖尖能完全接觸菌液，完全蓋上真空干燥器蓋子，在30-70kPa壓力下侵染6 12min ；(6)共培養(yǎng)侵染結(jié)束后，用吸管快速吸凈培養(yǎng)皿上多余的菌液，置于21 25°C繼續(xù)暗培養(yǎng)4 6天,直至長出新葉,且節(jié)根長至I 2cm ；(7)共培養(yǎng)結(jié)束后，將長出新葉的轉(zhuǎn)化苗用室溫下的自來水洗掉表面的培養(yǎng)基和菌體，然后將其整齊的移栽到土壤中，先置于人工氣候室避光生長2 3d，然后讓植株在日溫 22 28°C、夜溫15 21°C的條件下生長，直至植株3葉I心期...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：沈亞歐，潘光堂，江舟，楊珊，林海建，彭煥偉，張志明，羅旭，馬浪浪，李婉蓉，張兵，
申請(專利權(quán))人：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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